弓形蟲毒力因子ROP18激酶的致病分子機制研究.pdf

1、背景:
　　弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生蟲,可以感染幾乎所有的溫血動物,會引起世界范圍內(nèi)傳播的人獸共患病。免疫功能正常人群感染弓形蟲不會出現(xiàn)明顯癥狀,但免疫功能低下或缺陷者感染弓形蟲則會引發(fā)嚴重的并發(fā)癥,目前弓形蟲感染已經(jīng)成為AIDS和器官移植患者重要死亡因素之一?；蚪M數(shù)量特征分析、轉(zhuǎn)基因弓形蟲實驗及菌株雜交實驗均證明 ROP18能提高弓形蟲的增殖速率,對感染動物有致死作用,因此,ROP18是弓形蟲重要的毒力因子,本研究采用酵母雙

2、雜交方法篩選與ROP18相互作用的宿主蛋白,通過免疫沉淀、GST-pull down、酵母共轉(zhuǎn)以及免疫熒光進一步證實 ROP18與宿主 NF-κB p65的相互作用,提示 ROP18可能通過宿主NF-κB發(fā)揮其致病作用,為弓形蟲病致病機制研究提供依據(jù)。
　　目的:
　　采用酵母雙雜交法篩選與弓形蟲毒力因子ROP18相互作用的蛋白及ROP18與NF-κB p65相互作用的鑒定,為弓形蟲致病機制研究提供依據(jù)。
　　方法:<

3、br>　　本實驗分為兩部分:(1)RT-PCR擴增弓形蟲RH株速殖子ROP18基因片段,擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入酵母雙雜交誘餌載體 pGBKT7中,將重組質(zhì)粒導入酵母AH109菌株中,檢測誘餌載體是否有毒性和自激活作用,利用酵母雙雜交從人胚胎腦cDNA文庫中篩選與ROP18相互作用的蛋白;(2)RT-PCR擴增弓形蟲RH株速殖子ROP18基因片段,擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入 PCR blunt II Topo vector構(gòu)建pROP18,從

4、pROP18擴增出ROP18編碼序列,將純化的PCR產(chǎn)物克隆至pTUB8-mycGFPPftailTY,構(gòu)建pTUB8-ROP18-TY質(zhì)粒,將質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲RH株,弓形蟲懸浮液轉(zhuǎn)移到長有貼壁細胞的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黃嘌呤的DMEM篩選高表達ROP18的弓形蟲RH株,收集蟲體,腹腔注射昆明小鼠,免疫熒光檢測ROP18在轉(zhuǎn)基因弓形蟲株中的表達,吉姆薩染色比較RH株與高表達ROP18的RH株的細胞增

5、殖速率,酵母共轉(zhuǎn)、GST-pull down及免疫共沉淀證明ROP18與p65之間存在相互作用,免疫熒光雙標實驗觀察ROP18與宿主p65共定位。
　　結(jié)果:
　　1.ROP18相互作用的宿主蛋白的篩選
　　1)酶切鑒定表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2)用玻璃珠(美國Sigma公司)法提取轉(zhuǎn)了質(zhì)粒pGBKT7-ROP1825–251 aa的酵母蛋白,WB檢測顯示ROP18蛋白表達,陰性組不表達。
　　3)發(fā)現(xiàn)RO

6、P18全長具有自激活功能,因此用ROP1825-251aa為誘餌,篩選獲得一系列與ROP18相互作用的宿主蛋白:NF-κB p65蛋白、DNA損傷特異性結(jié)合蛋白1(DDB1)、轉(zhuǎn)錄激活因子ATF6β、torsinA相互作用蛋白1(TOR1AIP1)、溶質(zhì)運載蛋白3(SLC3A2)、Derl樣域家族成員2(DERL2)、酪氨酸硫化轉(zhuǎn)移酶2(TPST2)、OCIA結(jié)構(gòu)域蛋白1(OCIAD1)和整聯(lián)蛋白β1(integrinβ1)。
　

7、　2.ROP18與NF-κB p65相互作用的鑒定
　　1)將轉(zhuǎn)基因弓形蟲感染后的細胞固定和抽提以后,染Ty1鼠mAb(綠色)、DAPI(藍色),重疊圖像表明在弓形蟲頂端的棒狀體附近有ROP18蛋白表達。
　　2)吉姆薩染色證明R O P18過表達弓形蟲株較 R H株弓形蟲增殖快,ROP18能夠促進弓形蟲在細胞內(nèi)的增殖。
　　3)酵母共轉(zhuǎn):將p65構(gòu)建到pGADT7載體,然后與ROP18的酵母表達載體共轉(zhuǎn)至酵母AH10

8、9菌株,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培養(yǎng)基上驗證,結(jié)果表明p65是通過二聚化結(jié)構(gòu)域與ROP18相互作用。
　　4)細胞免疫熒光:將ROP18過表達的弓形蟲感染后的HFF細胞固定和抽提以后,共染Ty1鼠mAb(綠色)、p65兔mAb(紅色)、DAPI(藍色),重疊圖像表明弓形蟲ROP18和宿主NF-κB p65共定位于宿主細胞質(zhì)。
　　5)免疫共沉淀:將ROP18-Δ27-GFP與GFP分別轉(zhuǎn)

9、染293t細胞,用GFP抗體沉淀細胞裂解液中的p65,免疫沉降物經(jīng)SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移到NC膜上,分別用GFP和p65抗體雜交,發(fā)現(xiàn)p65存在于ROP18-Δ27-GFP的免疫復合物中,因此p65和ROP18可以在細胞內(nèi)發(fā)生相互作用。
　　6)GST-pull down:將純化后的帶GST標簽的ROP18蛋白與帶HIS標簽的p65-M蛋白進行GST-pull down實驗,發(fā)現(xiàn)p65-M能與ROP18直接相互作用,進一步驗證p6