Ups-fucoidan抑制小鼠肝癌Hca-F細胞淋巴道轉移的作用和機制研究.pdf

1、目的:惡性腫瘤發(fā)生轉移是腫瘤患者致死的主要原因，腫瘤轉移是由多基因控制的多步驟、多階段的復雜過程，并與腫瘤細胞的增殖、侵襲、黏附，血管轉移及淋巴管轉移密切相關。
　　褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是富含硫酸基團，并具有多種生物學活性的酸性雜多糖。而裙帶菜孢子葉來源的褐藻多糖硫酸酯(Ups-fucoidan)含有較高的硫酸根集團而具有更強的生物學活性，如:抗腫瘤、抗凝血、抗炎、誘導凋亡、免疫調節(jié)等，其中，Ups-fucoidan

2、的抗腫瘤活性成為了近年來抗腫瘤研究的熱點。
　　腫瘤細胞在發(fā)生發(fā)展及轉移過程中產生的相關分子，可刺激自身增殖、細胞外基質的降解及與淋巴結的黏附，進而促進其經淋巴道轉移。本研究對這些具有重要生物學功能的蛋白分子的表達量進行分析，探究腫瘤細胞淋巴管轉移的分子機制，這些相關分子包括:在細胞增殖和細胞周期調控起重要作用的細胞周期蛋白(cyclin D1)及其調控激酶(CDK4)，與降解細胞外基質(ECM)和腫瘤侵襲密切相關的基質金屬蛋白酶

3、家族(MMPs)及基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)，以及細胞與胞外基質及淋巴結黏附相關的黏附因子，如:整合素家族(Integrin)，CD44及L-選擇素(L-Selectin)等。此外，核轉錄因子(NF-κB)作為核內重要的調控因子，對多種蛋白的表達和活化具有調控作用，其活性依賴于磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)及細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)等信號通路的調節(jié);血管內皮生長因子C(VEGF-C)與其受體血管內皮生長因

4、子受體3(VEGFR-3)結合，可激活VEGF-C/VEGFR-3通路，進而調節(jié)其下游Akt和ERK信號通路的活化。肝細胞生長因子(HGF)與其受體受體酪氨酸激酶(C-Met)結合，會激活其下游ERK信號通路，進而對NF-κB起調控作用，NF-κB的活性變化與腫瘤細胞的增殖和轉移密切相關。
　　我們前期從海洋褐藻Undaria pinnatifida孢子葉中分離純化了Ups-fucoidan，并進行了理化性質分析。本研究以具有高淋

5、巴道轉移潛能的小鼠肝癌Hca-F細胞作為細胞模型，探討Ups-fucoidan對Hca-F細胞生長、黏附、侵襲轉移能力的影響及抑制淋巴道轉移的分子機制。
　　方法:1.采用MTT法檢測不同濃度Ups-fucoidan在不同時間點對小鼠肝癌Hca-F細胞增殖能力的影響，及增殖抑制率的變化。流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測Hca-F細胞對cyclin D1，CDK4表達的變化。

6、r>　　2.采用臺盼藍染色法檢測不同濃度Fucoidan處理Hca-F細胞24h后細胞的存活率，進而排除Ups-fucoidan的細胞毒作用。
　　3.通過Transwell實驗觀察Ups-fucoidan對Hca-F細胞遷移及侵襲能力的干預作用，并采用ELISA法檢測其分泌MMP-2，MMP-9水平的變化，Western blot法檢測TIMP-1，TIMP-3的表達水平。
　　4.冰凍淋巴結黏附實驗觀察Ups-fucoi

7、dan對Hca-F細胞與淋巴結(Lymph node，LN)黏附能力的影響，Western blot法檢測其對Hca-F細胞總蛋白中Integrinα5-β1，CD44，L-Selectin等相關黏附因子表達水平的影響。
　　5.Western blot法檢測Hca-F細胞胞內總蛋白中VEGFR-3，C-Met，PI3K/Akt，ERK和NF-κB等通路中信號分子的蛋白表達水平變化，ELISA法檢測Hca-F細胞胞外分泌HGF，V

8、EGF-C的水平，半定量RT-PCR法檢測timp-1，ve gfc和vegfr-3mRNA表達水平的變化。
　　結果:1.MTT實驗結果表明Ups-fucoidan可抑制Hca-F細胞增殖，其抑制作用具有時間劑量依賴關系，Annexin V/PI雙染結果表明Ups-fucoidan實驗組可顯著促進Hca-F細胞凋亡，并且Ups-fucoidan干預后cyclin D1和CDK4的表達量降低。
　　2.Ups-fucoida

9、n處理Hca-F細胞后，臺盼藍染色計數(shù)死亡細胞，同對照組相比，計算實驗組細胞的相對死亡率，結果顯示各組細胞死亡率均小于5.2％，表明Ups-fucoidan對Hca-F細胞增殖及存活的抑制并非細胞毒作用。
　　3.Transwell實驗結果表明，Ups-fucoidan減弱Hca-F細胞體外遷移及侵襲能力，ELISA實驗結果表明，Hca-F細胞分泌到細胞培養(yǎng)基上清液中MMP-2，MMP-9的含量下降，但同對照組相比無顯著差異;We

10、stern blot結果表明，Ups-fucoidan干預后，TIMP-1和TIMP-3蛋白表達水平均顯著上升，并具有濃度依賴關系。
　　4.黏附實驗結果表明，Ups-fucoidan可減弱Hca-F細胞對LN的黏附能力，1000μg/ml實驗組作用效果更為顯著，Western blot結果表明，Ups-fucoidan干預后Integrinα5-β1，CD44和L-Selectin等黏附因子的表達均下調。
　　5.Ups-

11、fucoidan干預后，Hca-F細胞胞內總蛋白中VEGFR-3，C-Met，PI3K/Akt，ERK，NF-κB信號通路中信號分子的蛋白表達水平均降低，并具有濃度依賴關系;ELISA結果表明，同對照組相比，處理組Hca-F細胞分泌VEGF-C和HGF的水平顯著下降， vegf-c和vegfr-3 mRNA表達水平下調，timp-1 mRNA表達上調。
　　結論:實驗結果表明Ups-fucoidan能抑制Hca-F細胞生長、侵襲、