STY及SPA的RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、【目的】
　　建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法，具體包括：
　?。?）傷寒沙門氏菌SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
　?。?）傷寒及甲型副傷寒沙門菌TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。評(píng)價(jià)以上方法的特異性、敏感性、檢測(cè)下限、以了解人群中對(duì)該菌的攜帶情況提高感染人群中傷寒及甲型副沙門氏菌的檢出率。
　　【方法】
　　對(duì)建立傷寒及甲型副傷寒沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法

2、，本研究采取以下實(shí)驗(yàn)方案：
　?。?）經(jīng)查閱資料后確定待測(cè)目的基因，并通過(guò)序列比對(duì)確定待檢測(cè)基因的保守序列STY1633（Salmonella Typhi）及SPA4289（Salmonella enterica serovars paratyphi A），然后借助探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer7.7設(shè)計(jì)單重及雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針。
　?。?）分別在1-10 nmol/L10個(gè)濃度梯度和2-10 nm

3、ol/L5個(gè)濃度梯度內(nèi)，在美國(guó)Bio-Rad公司的CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增比較，優(yōu)化引物和探針濃度。
　?。?）SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度、特異度的評(píng)價(jià)。
　?。?）SYBR Green法檢測(cè)糞便模擬標(biāo)本中的傷寒沙門菌，評(píng)價(jià)其敏感性、特異度、檢測(cè)下限、菌液增菌前后的檢測(cè)下限。
　?。?）單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度、特異度的評(píng)價(jià)。
　?。?）將優(yōu)化了的單重實(shí)時(shí)PC

4、R反應(yīng)體系組合成雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系，并評(píng)價(jià)其檢測(cè)下限。
　　【結(jié)果】
　　（1）利用SYBR Green法檢測(cè)糞便模擬標(biāo)本中的傷寒沙門菌純菌及10份傷寒患者標(biāo)本均擴(kuò)增陽(yáng)性，其余的非傷寒沙門菌、致腹瀉的其他5種腸道致病菌及引起發(fā)熱癥狀的8種常見非腸道病原菌純菌及相應(yīng)患者標(biāo)本均擴(kuò)增陰性。在對(duì)純傷寒沙門菌DNA檢測(cè)中，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法的檢測(cè)下限為500fg/反應(yīng)，即97個(gè)拷貝/反應(yīng)。以糞便模擬樣品提取DN

5、A為模板的檢測(cè)中，增菌前檢測(cè)下限達(dá)104 cfu/g，增菌后可達(dá)50cfu/g。
　?。?）在單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)傷寒沙門菌的反應(yīng)體系中，優(yōu)化后的反應(yīng)體系靈敏度和特異度均為100％。檢測(cè)傷寒沙門菌純菌DNA的檢測(cè)下限為100fg/反應(yīng)，即19.4個(gè)拷貝/反應(yīng),擴(kuò)增效率為90%。以傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測(cè)中，增菌前檢測(cè)下限即可達(dá)1cfu/g。
　　單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)甲型副

6、傷寒沙門菌純菌DNA的檢測(cè)下限2.5pg/反應(yīng)，即485個(gè)拷貝/反應(yīng)，擴(kuò)增效率為90%。以甲型副傷寒糞便模擬樣品提取DNA為模板的檢測(cè)中，增菌前達(dá)未檢出，但增菌后檢測(cè)下限可達(dá)10cfu/g。
　?。?）經(jīng)優(yōu)化的傷寒和甲型副傷寒雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，對(duì)兩種純菌DNA的檢測(cè)下限為分別為1pg/反應(yīng)和2.5pg/反應(yīng)，即194個(gè)拷貝/反應(yīng)和485個(gè)拷貝/反應(yīng)。對(duì)各自的糞便模擬樣品的檢測(cè)下限分別為：傷寒糞便模擬樣品

7、增菌前為102cfu/g，增菌后的檢測(cè)下限是1cfu/g；甲型副傷寒糞便模擬樣品增菌前為104cfu/g，增菌后的檢測(cè)下限是10cfu/g。
　　【結(jié)論】
　　本研究建立了基于STY1633基因及SPA4289的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該檢測(cè)法的特異度、靈敏度及檢測(cè)下限均較理想。尤其在單重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)傷寒沙門菌其檢測(cè)下限能達(dá)到19.4個(gè)拷貝/反應(yīng)，高于普通PCR檢測(cè)法的100-500倍。并