UL29shRNA表達質(zhì)粒與ACV對HSV-2抑制效果的比較.pdf

1、目的:針對單純皰疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type2, HSV-2)的UL29基因,構(gòu)建了4組短發(fā)夾RNA(Small hairpin RNA, shRNA)表達質(zhì)?！猵GPU6/GFP/Neo/shRNA UL29,并對 UL29shRNA表達質(zhì)粒進行了篩選。通過將篩選的 UL29shRNA表達質(zhì)粒與抗病毒藥物阿昔洛韋(Aciclovir, ACV)的抗病毒效果及細胞毒性進行比較,探討RNA干擾在細胞水平上

2、對HSV-2病毒的抑制效果。
　　方法:根據(jù)shRNA的一般設(shè)計原則,針對HSV-2的UL29基因設(shè)計出四組表達質(zhì)粒,通過病變抑制率、mRNA相對表達量從中篩選出一組干擾效果最好的表達質(zhì)粒—UL29-shRNA1641。以pGPU6/GFP/Neo/UL29-shRNA1641作為RNA干擾組與抗病毒藥ACV進行對HSV-2的抑制效果的比較研究。預(yù)實驗中通過CCK-8(Cell Counting Kit-8)法測定ACV的最大無毒

3、濃度(maximal atoxic concentration, TC0)和ACV的半數(shù)有效濃度(Half effective concentration, EC50),分別用于病毒抑制效果的實驗和細胞毒性的實驗。UL29-shRNA1641與ACV抑制HSV-2的實驗分為3個實驗組:RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組。采用CCK-8法檢測病變抑制率,實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantita

4、tive PCR, RT-PCR)檢測UL29mRNA的相對表達量, Karber法檢測細胞上清液中病毒滴度的變化、蛋白印跡法(Western blot)檢測ICP8的相對表達量,對 RNAi與 ACV抑制效果進行比較;通過 WST-1(Water-Soluble Tetrazolium-1)法和臺盼藍染色計數(shù)法對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物(質(zhì)粒+轉(zhuǎn)染試劑)和ACV的細胞毒性進行比較。
　　結(jié)果:(1)通過病變抑制率、mRNA相對表達量檢測表

5、明,4組UL29shRNA表達質(zhì)粒對HSV-2均有一定的抑制效果,以其中UL29-shRNA1461對基因表達抑制率最高,為最佳干擾組。(2)預(yù)實驗中 Karber法測定擴增后的病毒滴度為 TCID50=10-5.375/100μl,CCK-8法測定ACV的TC0和EC50分別為5.0μg/ml和31.7μg/ml。(3)CCK-8法檢測病變抑制率的結(jié)果顯示,RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組細胞病變抑制率分別為35.35±0.9

6、8％、43.95±1.31%和85.82±1.13%,其中RNAi組比ACV組病變抑制率低(P﹤0.05),RNAi+ACV組的病變抑制率明顯高于RNAi組和ACV組(P﹤0.05)。(4)RT-PCR檢測三組mRNA的相對表達水平,RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組均能不同程度降低mRNA相對表達量。RNAi組UL29基因相對表達量高于ACV組(P﹤0.05);RNAi+ACV組UL29基因相對表達量明顯低于RNAi組和ACV組

7、(P﹤0.05)。(5)Karber法檢測三組細胞上清液病毒滴度表明,陰性對照組的上清病毒滴度為10-5.4±0.3/100μl,RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組上清液病毒滴度分別為10-4.0±0.2/100μl、10-3.7±0.2/100μl和10-2.9±0.3/100μl,三組與陰性對照相比均有顯著性差異(P﹤0.05),RNAi組病毒滴度高于ACV組(P﹤0.05),RNAi+ACV組的病變病毒滴度明顯低于RNAi組

8、和ACV組(P﹤0.05)。(6)Western blot檢測ICP8相對表達量, RNAi組、ACV組和 RNAi+ACV組均能不同程度降低 ICP8表達,ACV組的 ICP8相對表達量比RNAi組低(P﹤0.05)。RNAi+ACV組ICP8相對表達量降低最為明顯,與ACV組和RNAi組相比有顯著差異(P﹤0.05)。(7)WST-1法對轉(zhuǎn)染復(fù)合物與ACV的細胞毒性進行比較, RNAi組和 ACV組細胞死亡率分別為23.65±1.3

9、3%和39.48±1.25%;臺盼藍染色計數(shù)法對轉(zhuǎn)染復(fù)合物和 ACV的細胞毒性進行比較,RNAi組和ACV組細胞死亡率分別為18.55±1.98%和42.22±3.23%。RNAi組與ACV組相比均有顯著性差異(P﹤0.05)。說明RNAi中質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑對細胞的毒性明顯小于ACV。
　　結(jié)論:設(shè)計的4組UL29shRNA表達質(zhì)粒均能抑制UL29基因和ICP8的表達。其中UL29-shRN1461干擾果最好。以UL29-shRN1