基于質(zhì)粒表達的siRNA對豬圓環(huán)病毒2型體內(nèi)外復制的抑制效應(yīng).pdf

1、分類號：S墨5：三密級：公玨一單位代碼：!QQ墨魚學號：2QQ墨壘魚Q基于質(zhì)粒表達的siRNA對豬圓環(huán)病毒2型體內(nèi)外復制的抑制效應(yīng)InhibitionofPlasmidbasedsiRNAontheReplicationofPorcineCircovirusType2(PCV2)inVivoandinVitro學位申請人：李曼指導教師：宋勤葉教授學科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學學位類別：農(nóng)學碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學答辯日期：二。一一年五月二十九日

2、＼刪l㈣㈣叭㈣n㈧㈨刪噬I堅‘Y1^M‘刁V摘要豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)是危害當今全球養(yǎng)豬生產(chǎn)的最重要的免疫抑制性疫病。目前仍沒有防治該病的理想疫苗和藥物，因此研究預(yù)防和治療PCVAD的新制劑具有重要的理論和實踐意義。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈小干擾(siIⅢA)引起的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，該技術(shù)在傳染性疾病、惡性腫瘤、心血管疾病等的治療研究領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。本研究構(gòu)建了PCV2特異

3、的siRNA表達質(zhì)粒，分析了其對PCV2增殖和致病性的抑制作用。針對PCV2的rep和cap基因，篩選了10個siRNA靶序列，設(shè)計并合成了10對編碼PCV2特異的shRNA的DNA寡核苷酸和l對PCV2非特異(SCR)的shRNA的DNA寡核苷酸。將ll對DNA寡核苷酸退火形成雙鏈，克隆到siRNA表達質(zhì)粒pGensil1的U6啟動子下游，構(gòu)建了PCV2特異的siRNA表達質(zhì)粒(pGensilC123、C297、C490、C563、C

4、645、R148、R259、R295、R484、R601)和對照質(zhì)粒(pGensilSCR)。在脂質(zhì)體介導下將構(gòu)建的siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK一15細胞，20h后感染500TCID50的PCV2。應(yīng)用實時熒光定量PCR(RealtimeFQPCR)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)、蛋白免疫印記(Westernblot)和免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)等技術(shù)檢測病毒DNA、mRNA及蛋白的合成與表達情況。結(jié)果表明，構(gòu)建的P

5、CV2特異的siRNA表達質(zhì)粒均能不同程度地抑制PCV2DNA、mRNA及Rep與Cap蛋白在PK15細胞內(nèi)的合成，其中針對C297、C490和R259三個靶位的siRNA的抑制效果更好。進一步研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后16hfl0可抑制PCV2的復制，且直到接毒后72h仍有明顯的抑制作用；當siRNA表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量為1pg時，病毒DNA濃度顯著低于轉(zhuǎn)染025Pg、05lag時的濃度；針對兩個或三個靶位的siRNA表達質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)染PK15

6、細胞對PCV2的抑制作用顯著增強。上述結(jié)果提示PCV2特異的siRNA表達質(zhì)粒對病毒的抑制作用具有長效性和劑量依賴性，針對不同靶位的siRNA表達質(zhì)粒混合轉(zhuǎn)染對PCV2具有抑制協(xié)同效應(yīng)。將128只8周齡BALB／c隨機分為8組，每組16只。第l、2組分別為只感染病毒的陽性對照(PC)組和不感染病毒的陰性對照(NC)組；第3、6組分別為空質(zhì)粒和SCR對照組，第4、5組為接種一種質(zhì)粒組，第7、8組為兩種質(zhì)粒混合組。其中第3～7組先接種質(zhì)粒2

7、4h后感染PCV2；第8組先感染PCV2，24h后接種質(zhì)粒。質(zhì)粒和病毒均通過腹腔與鼻腔途徑接種，質(zhì)粒接種劑量為50肛∥只，PCV2(105TCIDs401mL)的感染劑量為01mL／只。結(jié)果PCV2感染21d后，接種siRNA表達質(zhì)粒的各組小鼠的體重均顯著高于PC、空質(zhì)粒和SCR對照組的體重(PO05)。與PC、空質(zhì)粒和SCR對照組相比，接種siRNA表達質(zhì)粒組的抗體水平、血清中PCV2核酸檢出率以及組織中的PCV2載量均顯著降低(P0