shRNA表達(dá)載體對HSV-2ICP4基因的干擾效應(yīng).pdf

1、目的:構(gòu)建針對Ⅱ型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus type2，HSV-2）ICP4基因的短發(fā)夾RNA（small hairpin RNA，shRNA）重組表達(dá)載體，在細(xì)胞水平上觀察載體表達(dá)的shRNA對ICP4基因表達(dá)的抑制作用，以及對病毒復(fù)制的影響。
　　 方法:針對HSV-2 ICP4基因，設(shè)計(jì)、篩選得到1條擬干擾靶位點(diǎn)，構(gòu)建1組針對ICP4基因的短發(fā)夾RNA的真核表達(dá)載體，以及不針對該基因的陰性表達(dá)

2、載體shRNA NC。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人胚胎腎293株細(xì)胞(Human EmbryonicKidney cells，HEK293)，流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率，接種HSV-2。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測mRNA轉(zhuǎn)錄情況，Western blot檢測蛋白表達(dá)情況，終點(diǎn)滴定法檢測細(xì)胞上清液中的各組病毒滴度。
　　 結(jié)果:(1)酶切鑒定重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建成功。(2)重組載體轉(zhuǎn)染效率48h后達(dá)到最高值，轉(zhuǎn)染

3、效率可達(dá)80％。(3)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，與空白組比較，ICP4shRNA組可明顯降低ICP4 mRNA的表達(dá)水平(P＜0.05)，抑制率可達(dá)71.28％。
　　 (4) Westem blot結(jié)果顯示，與空白組比較，ICP4shRNA組可明顯降低ICP4蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05）。(5)終點(diǎn)滴定法檢測病毒活力，結(jié)果顯示，ICP4shRNA組可明顯降低子代病毒的活力(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)