Piwil2誘導3T3細胞惡性轉化的分子機制研究.pdf

1、研究背景：
　　Piwil2屬于Argonaute蛋白家族,是水母、小鼠和人類等不同生物干細胞自我更新均需要的一類基因。Piwil2在正常人體僅在睪丸和造血干細胞有表達,但在很多腫瘤組織和腫瘤細胞株均有表達。Chen et al證實,腫瘤干細胞(CSC)和腫瘤干細胞前體細胞(pCSC)特異表達Piwil2蛋白,是干細胞分裂中的重要的調(diào)控基因,在干細胞的分化和腫瘤形成和發(fā)展中起著重要的作用,腫瘤組織及腫瘤細胞株Piwil2的陽性表達

2、是由于pCSC/CSC存在的緣故。我們的研究也顯示,子宮頸癌干細胞特異表達Piwil2,且宮頸癌組織也高表達Piwil2,上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ/Ⅲ可見少量表達,而CINⅠ和正常宮頸上皮未見Piwil2表達。因此,Piwil2作為一種腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen,CTA),為腫瘤誘導分化治療提供了高度特異的作用靶點。
　　目的：

3、>　　觀察Piwil2對3T3細胞生物學行為的調(diào)控作用,并深入探討其分子機制。
　　方法：
　　1.構建pIRES2-EGFP-Piwil2真核表達重組質(zhì)粒。
　　2.利用Lipofectamine2000將pIRES2-EGFP-Piwil2質(zhì)粒轉入3T3細胞,經(jīng)過G418篩選,建立穩(wěn)轉細胞株3T3-Piwil2細胞。
　　3.利用細胞集落形成實驗觀察Piwil2對3T3細胞集落形成能力的影響。
　　4.

4、采用細胞直接計數(shù)方法觀察Piwil2對3T3細胞的增殖能力的影響。
　　5.利用FACS技術分析Piwil2對3T3細胞周期的調(diào)控作用。
　　6.利用Western blot檢測Piwil2下游相關基因:stat3\Bcl2\cyclinD1等7.利用裸鼠成瘤實驗,觀察高表達Piwil2基因后對3T3細胞成瘤能力的影響。
　　結果：
　　1.成功構建pIRES2-EGFP-Piwil2真核表達重組質(zhì)粒。
　

5、　2.建立穩(wěn)定表達Piwil2基因的3T3-Piwil2細胞,空載體轉染細胞3T3-EGFP細胞。
　　3.與3T3-EGFP細胞相比,高表達Piwil2基因的3T3-Piwil2細胞集落形成能力增強,組間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　4.與3T3-EGFP細胞相比,高表達Piwil2基因的3T3細胞增殖能力增強,組間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　5.細胞周期結果顯示,與3T3-EGFP細胞相比,3

6、T3-Piwil2細胞G0/G1期比例下降,S期比例顯著升高,組間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　6.Western blot結果顯示了Piwil2的高表達可以激活Stat3/Bcl-2并且增強Stat/cyclin D1的信號通路。
　　7.3T3-Piwil2細胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力增強,腫瘤體積顯著大于對照組,組間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　結論：
　　1.Piwil2誘導3T3細胞發(fā)生惡性