缺氧誘導因子(HIF-2α)通過TFDP3誘導肝癌細胞凋亡分子機制及臨床研究.pdf

1、氧氣是生化反應的底物,是生物體能量代謝不可缺少的底物,機體中缺氧會導致自由基的不正常積累,對DNA和蛋白產生損害,對細胞產生巨大的生存壓力。缺氧會迫使細胞通過能量代謝、生物合成、和氧化還原等一系列改變來適應氧氣濃度的改變;缺氧會導致細胞周期停滯,能量消耗減少:缺氧會刺激細胞生存因子和血管生成因子的分泌。盡管這些改變是由多種信號通路共同調控的,缺氧誘導因子(hypoxiainduciblefactosr,HIFs)在其中扮演著重要作用。研

2、究發(fā)現(xiàn)HIFs的下游基因功能涉及到葡萄糖的代謝(GLUT1,LDH),凋亡相關分子(BNIP3),pH值調節(jié)(CA9),血管生成(VEGFA,PDGF)等過程。大量的臨床數(shù)據(jù)表明HIFs在許多腫瘤中高表達,其表達通常與病人的預后較差,生存期短相關;試驗室數(shù)據(jù)也表明HIFs丟失會導致腫瘤生長減慢,血管生成減少,轉移能力降低,而過表達HIFs則可以挽救這些現(xiàn)象。
　　HIFs是由HIF-α和HIF-β亞基組成的異二聚體。哺乳動物有三種

3、HIF-α亞基:HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α,均可與HIF-β亞單位結合,其中HIF-1α和HIF-2α的功能研究較多。隨著研究的深入,越來越多的數(shù)據(jù)表明:HIFs與腫瘤的相關性是非常復雜的。首先,HIF-1α亞基的功能在不同腫瘤類型會有所不同:在腦癌、乳腺癌和卵巢癌中HIF-1α過表達與病人的預后差相關,但在非小細胞肺癌、頭頸癌中其表達與病人的預后較好相關。其次,HIF-1α和HIF-2α亞基雖然結構相似,但二者的功能并不

4、重疊,甚至相反。研究發(fā)現(xiàn),HIF-2α可與Myc復合物協(xié)同結合在目的基因啟動子區(qū)的HIF(HRE)和Myc(Ebox)的結合位點,促進c-myc的轉錄活性。HIF-1α雖然也可以通過PASB區(qū)域與Myc結合,但卻抑制其與靶基因的啟動子結合,從而下調c-myc激活的基因,上調c-myc抑制表達基因的活性。
　　我們組的前期研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在肝癌中廣泛表達,HIF-1α高表達與病人的高BCLC分期相關,HIF-1α高表達意味著血管

5、侵犯,是肝癌術后總體生存率和復發(fā)率的重要預測指標。目前,關于HIF-2α在肝癌的功能研究較少,本研究旨在通過臨床標本的回顧性分析探索HIF-2α在肝癌的功能,通過ChIPonchip等試驗手段篩選尋找HIF-2α下游效應分子,揭示分子機制,為HIF-2α在肝癌的臨床應用提供證據(jù)。
　　第一部分HIF-2α在肝癌組織中的表達及其臨床意義研究
　　本研究旨在分析HIF-2α在肝癌標本的表達情況,探索HIF-2α表達與肝癌發(fā)展的臨

6、床關系。通過對254例接受手術治療和157例術前接受TACE治療的肝癌臨床標本進行免疫組化染色,根據(jù)染色的強度和密度將病人分成高表達和低表達組;分析病人的臨床病理相關指標,研究HIF-2α表達水平與病人年齡、性別、肝炎病毒標志物、肝硬化、腫瘤大小、分化、包膜、TNM分期等臨床病理特征及患者的生存時間,生存率等的關系,擬在發(fā)現(xiàn)HIF-2α與肝癌病人的預后、總體生存時間、生存率等之間的相互關系。
　　結果發(fā)現(xiàn):與正常的肝臟相比,腫瘤中

7、HIF-2α的RNA水平顯著下降(p=0.04),254例接受手術治療的肝癌病人的免疫組化染色結果表明HIF-2α在大部分腫瘤中均有表達。根據(jù)HIF-2α表達強度,254例病人分成低表達組(＜50％)及高表達組(＞50％)。高表達組的五年總體生存率是61.5％:低表達組的是46.6％,高表達組顯著高于低表達組(p=0.023)。高表達組的平均生存時間是42.62個月,而低表達組的平均生存時間是36.33個月,二者差異顯著(p=0.028

8、)。單因素生存分析顯示AFP(p=0.007),GGT(p=0.004),腫瘤直徑(p＜0.001),腫瘤數(shù)目(p=0.003),包膜完整性(p=0.011),TNM分期(p=0.018)及。HIF-2α(p=0.023)均為影響病人5年總體生存的因素,其中AFP(p=0.045),腫瘤數(shù)目(p=0.009),TNM分期(p=0.050)也是影響病人無瘤生存的因素。高表達HIF-2α組的五年腫瘤復發(fā)率是60.7％;低表達組的五年腫瘤復發(fā)

9、率是63.4％,兩組的無瘤生存率無顯著差異(p=0.929);高表達組的平均無瘤生存時間是32.80個月,而低表達組的為30.00個月,二者差異不顯著(p=0.355)。為進一步分析HIF-2α在病人亞群中的預測作用,我們將254例病人按照年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、TNM等病理臨床指標進行分層,發(fā)現(xiàn)HIF-2α的預測作用主要存在于單腫瘤,腫瘤包膜完整,EdmonsonⅠ-Ⅱ期,年紀大于50歲病人中。在單腫瘤病人中HIF-

10、2α高表達的病人的生存率為67％,而低表達病人的生存率為48.7％(p=0.011);在腫瘤包膜完整的病人中,HIF-2α高表達的病人的生存率為71.6％,而低表達病人的生存率為60.3％(p=0.005);在EdmonsonⅠ-Ⅱ期的病人中,HIF-2α高表達的病人的生存率為66.7％,而低表達病人的生存率為50.9％(p=0.027);在TNMⅠ期病人中HIF-2α高表達的病人的生存率為65.5％,而低表達病人的生存率為50.0％(

11、p=0.04):在年紀大于50歲的病人中,HIF-2α高表達的病人的生存率為65.3％,而低表達病人的生存率為44.7％(p=0.01)。研究結果表明:HIF-2α在手術切除的肝癌標本中的表達情況與病人的總體生存相關,高表達意味著病人的預后較好,尤其是年齡大于50歲、腫瘤分期較早、包膜完整的單灶肝癌病人亞群中。
　　免疫組化染色結果表明HIF-2α在術前接受TACE治療的肝癌病人中廣泛表達,表達強度高于只接受手術治療的病人。同樣根

12、據(jù)HIF-2α的染色強度對這部分病人分成高表達組和低表達組,結果發(fā)現(xiàn)高表達HIF-2α組病人的生存率為27.1％,平均生存時間為37.15個月;低表達組病人的生存率為20.4％,平均生存時間為29個月,高表達HIF-2α組病人的術后總體生存要顯著高于低表達組病人(p=0.034)。術后復發(fā)分析結果發(fā)現(xiàn)高表達組的術后復發(fā)率為78％,低表達組的術后復發(fā)率為81.6％,二者之間無顯著差異(p=0.379),高表達組的平均復發(fā)時間為術后25.9

13、3個月,低表達組的復發(fā)時間為19.20個月,二者無統(tǒng)計學差異。研究結果表明:HIF-2α在手術切除前接受TACE治療的肝癌標本中的表達情況與病人的總體生存相關,高表達意味著病人的預后較好。
　　HIF-2α與臨床病例特征之間的相關性數(shù)據(jù)表明在254例標本中HIF-2α與AFP(p=0.025)、腫瘤直徑(p=0.001)相關性顯著。單因素分析表明HIF-2α、AFP、和腫瘤直徑是影響病人術后總體生存時間的重要指標,多因素分析表明腫

14、瘤直徑是預測病人術后總體生存時間的獨立預后指標。對術前接受TACE治療的病人多因素分析結果表明HIF-2α可以作為總體生存的獨立預測指標。這些數(shù)據(jù)提示HIF-2α可能通過影響腫瘤的生長而進一步影響病人的預后。
　　第二部分HIF-2α促進肝癌細胞凋亡,抑制肝癌的生長
　　本部分旨在通過研究HIF-2α對肝癌細胞生長的影響,分析HIF-2α影響腫瘤生長的原因。利用lipofection2000轉染質粒,構建高表達及knockd

15、ownHIF-2α的穩(wěn)轉細胞,利用CCK8法檢測HIF-2α對細胞生長的影響,利用免疫染色染色檢測細胞增殖和凋亡比例的改變,應用AnnexinV和PI染色法檢測細胞凋亡等分析HIF-2α水平對肝癌細胞生長、增殖、及凋亡的影響。利用免疫缺陷的裸鼠模型研究HIF-2α水平對肝癌生長的影響。
　　結果發(fā)現(xiàn):與正常的轉入空載體的細胞相比,過表達HIF-2α可以顯著抑制細胞的生長(p＜0.001),而下調HIF-2α水平對細胞生長沒有顯著抑

16、制。對細胞增殖和凋亡分析發(fā)現(xiàn):在MHCC97H和MHCC97L細胞中,Ki67陽性細胞比例均沒有隨著HIF-2α的水平而有明顯變化,但HIF-2α高表達顯著提高了活化的Caspase3陽性細胞比例;AnnexinV和PI染色,流式檢測發(fā)現(xiàn)HIF-2α高表達組的細胞凋亡比例高達26％。Realtime:PCR結果發(fā)現(xiàn)凋亡相關基因,如Caspase7,Caspase8,BID的水平顯著上調。小鼠體內試驗顯示:過表達HIF-2α組的腫瘤明顯小

17、于對照空載體組的腫瘤,約為其重量的1/10,差異顯著(p＜0.001),knockdownHIF-2α組的腫瘤重量稍小于空載體組腫瘤,差異不顯著;對腫瘤的免疫組化染色結果顯示:HIF-2α高表達組的Activated-Caspase3陽性細胞的比例明顯增高。
　　研究表明:HIF-2α與肝癌細胞的生長關系密切,對肝癌細胞增殖沒有影響,但可以促進肝癌細胞的凋亡,抑制肝癌細胞的生長,進而抑制腫瘤的生長。
　　第三部分HIF-2α

18、抑制TFDP3基因的表達,促進E2F1信號通路,誘導肝癌細胞凋亡
　　本部分旨在應用ChIPonchip技術檢測篩選HIF-2α在肝癌細胞系MHCC97H中調控的下游靶基因,探索HIF-2α促進肝癌細胞凋亡,抑制腫瘤生長的作用機理。利用KEGG數(shù)據(jù)庫將所得到的基因進行功能和信號歸類,挑選其中影響細胞的增殖、凋亡及轉移等的基因,并在MHCC97L,與MHCC97H同源的另一個肝癌細胞系中,利用ChIPPCR驗證ChIPonchip結

19、果;利用實時定量PCR在過表達HIF-2α的MHCC97H細胞系和對應的空載體細胞中檢測下游靶基因的轉錄水平變化;挑選變化較大的基因,通過上調或下調該靶基因的水平,分析其在HIF-2α誘導肝癌細胞凋亡過程中的作用。
　　結果發(fā)現(xiàn):通過ChIPonchip,我們篩選到330個HIF-2α的靶基因;通過功能分析及信號通路分析,發(fā)現(xiàn)這些基因主要涉及到ErbB、p53、MAPK、TGF-β、Wnt、和Hedgehog信號通路;根據(jù)對基因富

20、集的峰值得分和峰值誤差排序,結合基因的功能及信號通路歸類,我們挑選了了部分基因(GZF1、RUNX1、RADIL、TFDP3、MMP16、FNDC1、GSPT1)在MHCC97L細胞中對其進行驗證。Chip-PCR結果表明:與對照IgG相比,大部分基因在HIF-2α組中高富集,與ChIPonChIP的一致。RealtimePCR結果顯示在高表達HIF-2α的:MHCC97H細胞中FNDC1、TFDP3基因的表達水平顯著下降,其中TFDP

21、3基因的下降幅度高達10倍。我們發(fā)現(xiàn)細胞中過表達HIF-2α導致TP73和ARF基因的RNA水平上調2倍以上,14-3-3σ、NOXA、GADD45α、和BID的上調倍數(shù)也在2倍以上,TP53、TP53INP2、P21、CyelinD1和BAK1的RNA水平有少量變化。當細胞中TFDP3和HIF-2α兩基因的表達水平同時上調時,ARF、14-3-3σ、NOXA、GADD45α、和BID基因的表達水平與轉入空載體的相當;與單獨高表達HIF

22、-2α組的相比,ARF、14-3-3σ、NOXA、GADD45α、和BID基因的表達水平顯著下降;TP53、TP53INP2、P21、CyclinD1和BAK1基因的轉錄水平均有不同程度的下調。在過表達HIF-2α的MHCC97H和MHCC97L細胞中同時過表達TFDP3基因,通過免疫染色我們發(fā)現(xiàn)Activated-caspase3細胞陽性比例顯著下降,流式檢測結果顯示早期凋亡細胞的比例從20％降到12％。
　　研究結果表明:TF

23、DP3是HIF-2α的下游靶基因之一,其表達水平受到HIF-2α的抑制;細胞中過表達HIF-2α可以提高E2F1通路的下游靶基因的轉錄水平,細胞中同時過表達HIF-2α和TFDP3可以部分抑制E2F1信號通路,減少HIF-2α過表達引發(fā)的細胞凋亡。以上結果顯示HIF-2α通過抑制TFDP3基因的轉錄而促進E2F1信號通路活性,從而導致肝癌細胞的凋亡。
　　結論
　　1.在本研究中,我們回顧性研究分析了254例接受手術治療的肝

24、癌標本,結果發(fā)現(xiàn)血清中AFP水平較高、腫瘤直徑較大的病人的HIF-2α表達水平較低。腫瘤標本的HIF-2α表達水平低的病人與表達高的病人相比,其總體生存時間較短,生存率低。在肝癌中高表達HIF-2α的病人,預后較好。
　　2.HIF-2α在術前接受TACE治療的肝癌病人中的預測作用與只接受手術治療的病人相同。肝癌中HIF-2α低表達的病人的生存時間和生存率顯著低于高表達的病人。單因素分析結果表明腫瘤中低表達HIF-2α與病人的總體

25、生存率低相關,多因素分析結果表明腫瘤中HIF-2α的表達水平是病人總體生存率的獨立預后指標。
　　3.體內試驗結果表明過表達HIF-2α的MHCC97H細胞在裸鼠中產生的腫瘤顯著小于轉入空載體的細胞產生的腫瘤,體外實驗結果也表明過表達HIF-2α顯著降低肝癌細胞的生長速度。這些數(shù)據(jù)與我們的臨床數(shù)據(jù)是一致的,均表明HIF-2α與腫瘤的生長關系密切,高表達HIF-2α的腫瘤直徑較小。
　　4.增殖和凋亡的相關指標檢測結果表明HI

26、F-2α可以促進肝癌細胞的凋亡,對細胞的增殖影響不明顯。
　　5.通過ChIPonchip技術,我們發(fā)現(xiàn)在MHCC97H細胞中存在330個HIF-2α的潛在下游靶基因。TFDP3是HIF-2α的下游靶基因之一,其轉錄水平受到HIF-2α的抑制,通過外源性轉入恢復TFDP3基因的表達水平可以顯著降低HIF-2α引發(fā)的細胞凋亡,E2F1信號通路中的相關凋亡基因水平顯著下調。這些數(shù)據(jù)表明TFDP3在HIF-2α引發(fā)的凋亡中起著重要的作用

27、。
　　創(chuàng)新點
　　1.我們首次發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HIF-2α表達水平較正常組織的降低,肝癌組織中HIF-2α低表達的病人的總體生存時間和生存率明顯低于高表達病人,肝癌組織中的HIF-2α表達水平與病人的總體生存相關。
　　2.我們首次發(fā)現(xiàn)TFDP3是HIF-2α的下游靶基因。
　　3.我們首次發(fā)現(xiàn)HIF-2α通過抑制TFDP3基因的表達促進E2F1信號通路引發(fā)的凋亡。
　　潛在應用價值
　　1.我們結果