大腸癌mtDNA誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文大腸癌mtDNA誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究姓名：姬宏莉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（消化系?。┲笇?dǎo)教師：肖冰20070510中文摘要D一環(huán)區(qū)包括重鏈的復(fù)制起點(diǎn)等重要序列，成為研究熱點(diǎn)。本課題組前期已完成以大腸癌細(xì)胞／組織、癌旁正常組織以及大腸癌患者和正常人外周血白細(xì)胞為對照，通過PCR、PcR—SscP等技術(shù)分析大腸癌細(xì)胞／組織以及癌旁組織、大腸癌患者外周血白細(xì)胞mtONA變異，包括點(diǎn)突變、缺失、DNA

2、的不穩(wěn)定性等變化的特征及規(guī)律；并構(gòu)建人大腸癌細(xì)胞及正常人血白細(xì)胞線粒體DNA重組表達(dá)載體。本課題旨在通過將大腸癌細(xì)胞突變的mtDNA片斷轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的mDNA改變的特點(diǎn)和mtDNA片段在成纖維細(xì)胞核內(nèi)的整合情況，及進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，并把轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于裸鼠，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的致瘤作用及mtDNA在成瘤細(xì)胞核內(nèi)的整合。以便明確變異的mt蜊A造成大腸癌發(fā)病的機(jī)制和作用。方法1通過雙酶切和單

3、酶切，ABl377測序儀全自動正反雙向測序，并與線粒體基因庫數(shù)據(jù)對照(http／／wwwncbinlmnihgov／BLAST／)，鑒定已構(gòu)建的突變的大腸癌pcDNA31()一$w480mtDNA、pcDNA31()一LovomtDNA、pcDNA31()一NhWBCmtDNA重組載體及pcDNA3。l()空載體。2通過脂質(zhì)體法(1ipofection2000TM)，將大腸癌細(xì)胞突變的mtONA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，利用G4

4、18抗性篩選；用熒光標(biāo)記的染色體原位雜交(FISH)觀察mtONA在核內(nèi)豹整合情況；觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞異型性及進(jìn)行染色體核型分析；PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞線粒體突變情況；流式細(xì)胞儀(FCM)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡情況：用四唑鹽比色法(啪盯)測定在不同時(shí)間、不同組問細(xì)胞增殖的吸光度值，用SPSSIO0軟件，定量數(shù)據(jù)重復(fù)測量的方差分析法，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3將穩(wěn)定陽性克隆細(xì)胞株接種于BALB／C裸鼠皮下，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的致瘤作用。結(jié)果1已構(gòu)建的真核表達(dá)載