忽地笑葉相關(guān)基因表達(dá)及克隆分析.pdf

1、忽地笑(Lycorisaurea)為石蒜屬植物代表種，是優(yōu)良的觀賞植物和藥用植物。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，主要包括栽培繁育技術(shù)、染色體核型分析、重要藥用成分提取等方面，但是有關(guān)其遺傳發(fā)育方面的研究尚未見報(bào)道。本文利用基因芯片技術(shù)，開展了一種忽地笑突變體與野生型葉器官之間的基因表達(dá)差異分析，為進(jìn)一步探討其葉發(fā)育分子機(jī)制提供了依據(jù)。 忽地笑屬平行脈序類型，主脈與各側(cè)脈縱向平行排列，各縱向脈之間有橫向二級(jí)側(cè)脈相連，一般二級(jí)側(cè)脈不

2、顯著。本研究所選材料為一種忽地笑突變型，稱為RaisedSecondaryLateralVeinsmutant(RSLV)，其葉片遠(yuǎn)軸面二級(jí)側(cè)脈顯著凸起，部分葉片尖端彎曲；生長(zhǎng)勢(shì)弱于野生型，葉色暗綠，相對(duì)較??；另外，雄蕊完全退化，成為只有雌蕊的重瓣單性花。 利用表達(dá)型噬菌體載體ZAP構(gòu)建了野生型和突變體忽地笑葉片cDNA文庫(kù)，分別隨機(jī)挑取cDNA克隆進(jìn)行5’端測(cè)序，共得到3122條有效ESTs。利用這些ESTs序列，設(shè)計(jì)512條

3、70mer的特異性序列作為寡核苷酸探針，代表512個(gè)基因，點(diǎn)制芯片，對(duì)忽地笑野生型和突變體葉器官進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，比較二者間轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)差異。芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證，最終確定所檢測(cè)的基因中，突變型和野生型有5個(gè)基因表達(dá)顯著差異，包括與維管發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的韌皮部蛋白2基因(phloemprotein2，PP2)；與鐵元素貯存、分配，維持細(xì)胞內(nèi)鐵離子平衡相關(guān)的鐵蛋白(ferritin)基因；催化果膠