外燥致病機制的實驗研究.pdf

1、本研究的理論基礎及指導思想“秋傷于燥”、“燥氣先傷于華蓋”、“燥勝則干”等經(jīng)典理論均指出燥邪特點其形成與時令有關。后世論燥，或描其象，或述其性，其文又散在于少數(shù)名家精選病案之中，宏觀的理論框架與缺乏系統(tǒng)的科學依據(jù)對其病因病機的精細闡析，成為對六淫之燥邪病因病機研究的重點問題之一。查閱近30年國內(nèi)外文獻資料，未見對外燥致病機理的系統(tǒng)實驗研究和對溫燥與涼燥“溫度-濕度”空間量化指標的研究報道。如何運用多學科的現(xiàn)代科學理論與技術(shù)，模擬符合中醫(yī)

2、六淫病因理論中關于外燥之溫度、濕度等空間量化指標，在此基礎上探索建立外燥動物模型和開展更深入的研究，更是外燥病因病機研究中的“敏感性”課題之一。完整地模擬某個季節(jié)氣候及變化以研究與疾病的關系是困難的，選擇一個較小的時間段如一個季節(jié)，結(jié)合多學科理論與技術(shù)，是研究時令性疾病的有效途徑之一。 本課題在《內(nèi)經(jīng)》“天人相應”指導下，遵循《內(nèi)經(jīng)》外燥致病的理論和后世名家思想與學說，在對外燥病邪進行理論回顧的基礎上，根據(jù)氣象學中“候平均氣溫”

3、、“季平均溫度”，擬以具有典型大陸氣候特征的華中地區(qū)的鄭州秋季之平均溫度和相對濕度，結(jié)合現(xiàn)代免疫學、醫(yī)學微生物學、分子生物學、血液流變學、組織病理學等理論與技術(shù)，首次模擬六淫燥邪之溫燥與涼燥的“溫度-濕度”量化空間并篩選相應指標，探索初步建立外燥小鼠模型；以檢測“肺系”生理功能為主要切入點，選擇反映外燥對“肺系”生理功能影響的相關指標，開展呼吸道液黏多糖與“肺津生成”、氣道纖毛運動試驗與“纖毛-黏液毯”生物防御屏障與氣道免疫功能、血液流

4、變學與“津血同源”及“燥勝則干”、氣道細胞凋亡與bcl-2、bax基因表達、對細菌攻擊的敏感性、氣管、肺與皮膚病理組織學，以及經(jīng)典方劑對溫燥與涼燥的治療效應等綜合性研究，旨在為闡析外燥傷肺、傷津、“燥勝則干”之病因病機宏觀理論框架提供科學實驗根據(jù)，填補外燥病因病機系統(tǒng)性實驗研究的“空白”，豐富六淫燥邪病因理論，為研究治療秋燥之經(jīng)典方作用機制提供基礎模型和量化檢測指標，具有理論創(chuàng)新和臨床指導意義。 1材料1.1實驗動物：昆明種小鼠

5、(SPF級)，體重18±1g，雌雄各半，湖北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2003-2005。 1.2標準細菌菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC25923，北京天壇生物制品公司)。 1.3主要儀器：LRH-250人工智能氣候箱(溫度：30-65℃±1℃，相對濕度：30％-90％±5％，廣東醫(yī)療器械廠)；MASTER-K30H風扇程控儀(韓國Best機電有限公司)，XSJ-D恒溫倒置顯微鏡(重慶)，紫外分光光度計

6、(756MC，上海精密科學儀器有限公司)，-85℃低溫冰箱(VXE380，法國)，酶標檢測儀(KHBST-360，上海)，F(xiàn)ASCO-全自動血液流變儀(重慶南方醫(yī)療設備公司)，細菌菌落計數(shù)器(JLQ-S，江蘇)，圖像分析系統(tǒng)(HPIAS-1000，華中科技大學同濟醫(yī)學院提供)。 1.4主要試劑：咔唑(054K078，Sigma公司)、D-葡萄糖醛酸內(nèi)酯(2711EC，Sigma公司)、羊抗鼠IgGELISA試劑盒(華美生物工程公

7、司，200501)、TUNEL試劑盒(MK1020)、Bcl-2兔IgG多抗(BA0412，200503)、bax兔IgG多抗(BA0315，200503)、各陽性對照片均購自武漢博士德生物工程有限公司，有效期內(nèi)使用。 1.5實驗藥物：桑杏湯/杏蘇散組方源自《溫病條辨》。生藥由湖北省荊州市中藥材公司提供，經(jīng)鑒定系正品。取一劑，加3倍水浸泡2小時后微火煎至100ml、重復3次，取3次煎液過濾混勻并水浴濃縮至200ml，其生藥量為0

8、.360g/L。按臨床成人用劑量計算，治療組小鼠按0.009g·kg-1·d-1生藥量灌胃處理，1次/天，連用5天。對照組用無菌生理鹽水代替藥物。 2方法2.1造模條件：將560只昆明種小鼠(SPF級)分為常溫常濕組、常溫燥組、溫燥組、涼燥組，140只/組。分批購進的各組小鼠根據(jù)實驗設計，分批置于人工氣候箱內(nèi)，用昆明種小鼠顆粒飼料飼養(yǎng)，按表1模擬外燥“溫度-相對濕度-風”綜合條件刺激造模。 表1各組小鼠“溫度-相對濕度-

9、風”處理條件組別溫度(℃)相對濕度(RH，％)風速(m/S)處理小時/天(h/d)常溫常濕15±270±22.55常溫燥15±233±22.55溫燥22±233±22.55涼燥8±233±22.552.2實驗檢測項目：各組于處理后第7天和第14天按文獻方法檢測以下項目：2.2.1氣管、肺、背部皮膚與足墊皮膚組織病理學觀察：常規(guī)病理組織學方法。 2.2.2氣道液黏多糖檢測：咔唑比色法。 2.2.3腸道液黏多糖檢測：咔唑比色

10、法。 2.2.4氣管上皮纖毛運動試驗：離體氣管纖毛試驗法。 2.2.5血清IgG抗體與氣道液IgG抗體：酶聯(lián)免疫吸附試驗。 2.2.6血液流變學檢測：全自動血液流變學檢測法。 2.2.7脾臟與胸腺平均重量測定：常規(guī)稱重法。 2.2.8糞便含水率測定：剖取結(jié)腸糞便稱重法。 2.2.9氣管上皮細胞凋亡與bcl-2、bax基因表達檢測：細胞凋亡用TUNEL法；bcl-2、bax基因表達用免疫組化

11、法。 2.2.10外燥小鼠對細菌攻擊敏感性：經(jīng)鼻接種細菌后常規(guī)檢測小鼠肺細菌數(shù)。 2.2.11桑杏湯對溫燥小鼠的治療效應：檢測2.2.2至2.2.8之項目。 2.2.12杏蘇散對涼燥小鼠的治療效應：檢測2.2.2至2.2.8之項目。 3統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以(x±s)表示，采用SPSS13.0軟件，資料之間比較用ANOVA分析，顯著性檢驗采用多個樣本均數(shù)間q檢驗(Newman-Keuls法)；各組第7天與

12、第14天比較用t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，檢驗水準為雙側(cè)a=0.05。 3結(jié)果3.1組織病理學觀察。結(jié)果顯示，第14天溫燥組氣管上皮鱗狀化生與炎性細胞浸潤，氣管纖毛倒伏、粘連或片狀缺損，≥40％氣管黏膜漿液腺上皮黏液腺化生，肺泡充血、水腫；皮膚毛枯色糙、新毛生長受阻、毛球數(shù)急驟減少與皮下脂肪增生；足墊皮膚角化層疏松，結(jié)締組織增生與汗腺減少，各項指標均較第7天為重。 上述病理變化與燥傷肺津，宣輸失司，更致皮膚

13、失之濡養(yǎng)有關。涼燥組氣管上皮鱗狀化生、氣管纖毛多呈灶狀缺損，≥20％氣管黏膜漿液腺上皮黏液腺化生，肺部瘀血、水腫；足墊皮膚結(jié)締組織增生與汗腺減少，其機制與涼傷肺陽而致肺津不化、凝成痰飲有關。結(jié)果顯示外燥致病確有其組織細胞學基礎，為“肺主皮毛”之理論提供證據(jù)。 3.2外燥對氣管纖毛運動與氣道液生成的影響。與常溫常濕組第7天與第14天相對穩(wěn)定的氣管纖毛運動(17.56±1.96、17.89±1.96)與氣道液分泌(513.77±24

14、3.67、544.89±227.88)比較，常溫燥組第7天氣道液分泌略增加，氣管纖毛運動加快，至第14天該組氣道液分泌減少，同期氣管纖毛運動更快(P＜0.01)。溫燥組第7天氣道液分泌代償性增加(846.11±287.70)、氣管纖毛運動速度加快(13.56±1.74，P＜0.01)；第14天氣道液分泌減少(342.22±107.91)、氣管纖毛運動減緩(15.75±2.46，P＜0.01)。涼燥組第7天氣道液分泌減少、氣管纖毛運動加快

15、不明顯，但第14天氣道液分泌增加、氣管纖毛運動加快(P＜0.01)。盡管與外燥相關的三組的氣道液分泌與氣管纖毛運動值不盡相同，但其趨勢是，當氣道液分泌增加時，氣管纖毛運動加快；當氣道液分泌減少時，氣管纖毛運動減緩。表明外燥傷肺、耗津之時，因致氣道液分泌減少而損傷其對氣道“纖毛-黏液毯”生物防御屏障的保護作用。 3.3血液流變學試驗。與常溫常濕組相比，在溫燥組第7天氣道液分泌代償性增高、第14天氣道液分泌明顯減少，溫燥耗傷肺津致血

16、之生成匱源，不僅滲入脈內(nèi)之津液不足，脈內(nèi)之津反而滲入脈外，更加重血量不足；該組血漿粘度、低切全血粘度、還原粘度、中切全血粘度、高切全血粘度升高(P＜0.01)；血容量減少時，溫燥組同一切變率下全血還原粘度、紅細胞聚集指數(shù)、紅細胞電泳指數(shù)增高，顯示紅細胞聚集性增高；高切變率下全血粘度、紅細胞剛性指數(shù)增高，紅細胞平均血紅蛋白濃度增高，表明紅細胞變形性減低(P＜0.01)。 3.4抗體水平檢測。與常溫常濕組第7天與第14天抗體水平相比

17、(6.01±0.74、5.68±0.64)，常溫燥組、涼燥組小鼠血清IgG抗體變化無顯著性(P＞0.05)，涼燥組氣道IgG抗體增高(7.95±0.77，8.82±0.71，P＜0.01)；溫燥組第14天血清IgG抗體增高(11.18±1.15)，特點是第7天與第14天氣道IgG抗體顯著減少并持續(xù)低水平(2.13±0.29，2.66±0.77，P＜0.01)，表明溫燥傷耗肺、耗津與肺津生成減少之時，彌散入氣道的IgG抗體含量隨溫燥之延長