外照射聯(lián)合靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、癌癥仍是目前威脅人類生命健康的重要疾病之一。放射治療是傳統(tǒng)且有效的治療手段之一。近年放療技術(shù)不斷改進(jìn),開展了三維適形放療、調(diào)強(qiáng)放療、圖像引導(dǎo)放療和Tomotherapy等,這些技術(shù)都提高了放射治療的有效率。但是因腫瘤類型、分期、靶區(qū)內(nèi)正常組織的劑量限制、微轉(zhuǎn)移灶、放療后產(chǎn)生乏氧和抵抗等因素一定程度上限制了其療效。 隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展,人們?cè)诓粩嗵剿靼┌Y分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制的同時(shí),意識(shí)到如果能夠針對(duì)癌癥的特異性變化進(jìn)行治

2、療,將會(huì)大大改善治療效果。因此靶向治療應(yīng)運(yùn)而生。它以腫瘤細(xì)胞的特異性改變?yōu)樽饔冒悬c(diǎn),是一種有的放矢的治療方法。 放射免疫治療是靶向治療的一種。它集免疫學(xué)、放射生物學(xué)、腫瘤放射治療學(xué)、腫瘤內(nèi)科學(xué)和核醫(yī)學(xué)為一身的腫瘤治療方式。其利用靶向抗體攜帶的核素發(fā)出的射線持續(xù)照射腫瘤細(xì)胞,因此對(duì)腫瘤微轉(zhuǎn)移灶及乏氧、射線抵抗細(xì)胞有一定的優(yōu)勢。雖然其在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中取得了令人鼓舞的結(jié)果,但是單獨(dú)治療實(shí)體瘤時(shí),靶區(qū)劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到治療劑量,因而限

3、制了其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用。 溶瘤病毒治療是利用基因工程改造的病毒在特異的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并溶解細(xì)胞,釋放出來的子代病毒繼續(xù)感染周圍的腫瘤細(xì)胞周而復(fù)始?xì)缒[瘤。雖然單一病毒治療在體外實(shí)驗(yàn)中有效,但是臨床療效并不令人滿意。但有資料表明,聯(lián)合放化療后可增加治療效果。 合理、有計(jì)劃的綜合治療可以充分利用和發(fā)揮各種治療手段的優(yōu)缺點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過體內(nèi)/外實(shí)驗(yàn)研究放免新藥碘[131I]標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單抗(131I-chTNT

4、)和條件復(fù)制溶瘤病毒Ad-MK聯(lián)合放療后對(duì)腫瘤的影響,希望能夠?yàn)榕R床的合理應(yīng)用提供有益的借鑒。 第一部分外照射聯(lián)合碘[131I]標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單抗對(duì)C57BL/6小鼠Lewis瘤影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究外照射聯(lián)合不同途徑注射碘[131I]標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單抗(131I-chTNT)對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長的影響并觀察131I-chTNT在小鼠體內(nèi)的分布和顯像。 方法:建立C57BL/6近交系小鼠Le

5、wis瘤模型,當(dāng)接種于右后肢的腫瘤直徑達(dá)指定大小時(shí)隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)分布和活體顯像實(shí)驗(yàn)分為兩組:①單藥組:靜脈或瘤內(nèi)給藥;②聯(lián)合組:外照射15Gy 24小時(shí)后再以不同途徑給藥。分別于給藥后不同時(shí)間測量腫瘤組織及感興趣器官的放射性,并觀察活體顯像情況。荷瘤小鼠腫瘤生長效應(yīng)實(shí)驗(yàn)分為四組:①空白對(duì)照組;②單藥組:靜脈或瘤內(nèi)給藥;③照射組:外照射15Gy;④聯(lián)合組:外照射15Gy 24小時(shí)后再以不同途徑給藥。觀察指標(biāo)為腫瘤生長延遲時(shí)間。

6、 結(jié)果:(1)外照射聯(lián)合尾靜脈注射131I-chTNT荷瘤小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)中單藥組和聯(lián)合組腫瘤組織的放射性在給藥24小時(shí)最高,聯(lián)合組高于單藥組,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018),直至72小時(shí)、120小時(shí)聯(lián)合組腫瘤組織放射性仍高于單藥組,P值分別為0.041、0.024。兩組中正常組織的放射性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?;铙w核素顯像中兩組均在給藥3天時(shí)腫瘤區(qū)放射性濃聚最集中,持續(xù)至7天仍可見腫瘤影像。聯(lián)合組腫瘤區(qū)比單藥組

7、的濃聚強(qiáng)且持續(xù)時(shí)間長。荷瘤小鼠腫瘤生長效應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明:單藥組、外照射組、聯(lián)合組的絕對(duì)延遲時(shí)間分別為(3.1±1.75)天、(9.1±1.86)天和(13.1±2.6)天,標(biāo)準(zhǔn)化延遲時(shí)間為10天,131I-chTNT對(duì)放射的增益因子為1.08。 (2) 外照射聯(lián)合瘤內(nèi)注射碘131I-chTNT的荷瘤小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)中單藥組和聯(lián)合組腫瘤組織的放射性均在給藥24小時(shí)最高,聯(lián)合組高于單藥組,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023),直至7

8、2小時(shí)聯(lián)合組腫瘤組織放射性仍高于單藥組(P=0.038)。兩組中正常組織的放射性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?;铙w核素顯像中兩組均在給藥1天時(shí)腫瘤區(qū)濃聚最高,至7天仍可見腫瘤影像。聯(lián)合組比單藥組腫瘤區(qū)放射性濃聚強(qiáng)而且持續(xù)時(shí)間長。荷瘤小鼠腫瘤生長效應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明:單藥組、外照射組、聯(lián)合組的的絕對(duì)延遲時(shí)間分別為(3.3±1.75)天、(6.0±2.02)天和(9.5±1.93)天,標(biāo)準(zhǔn)化延遲時(shí)間為6.2天,131I-chTNT對(duì)放射的增益因

9、子為1.03。 結(jié)論:外照射聯(lián)合靜脈和瘤內(nèi)注射131I-chTNT后可促進(jìn)乃131I-chTNT在荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤區(qū)的濃聚,但不增加對(duì)正常組織的影響。二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)131I-chTNT可提高外照射對(duì)荷瘤小鼠的放射效應(yīng)。 第二部分外照射及絲裂霉素聯(lián)合復(fù)制型溶瘤腺病毒Ad-MK對(duì)膀胱癌細(xì)胞的作用 目的:以Midkine(MK)基因作為特異啟動(dòng)子的條件復(fù)制溶瘤腺病毒Ad-MK可在MK mRNA高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中特異性的

10、復(fù)制而殺滅腫瘤。本實(shí)驗(yàn)擬探討膀胱癌細(xì)胞中MK mRNA的表達(dá),進(jìn)而研究Ad-MK對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響以及聯(lián)合放療、絲裂霉素后對(duì)細(xì)胞的作用,為臨床膀胱癌綜合治療提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 方法:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測淺表型和惡性浸潤性膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株BIU-87、EJ中MK mRNA的表達(dá)及Ad-MK感染細(xì)胞后,細(xì)胞中腺病毒Ela mRNA的表達(dá)。采用倒置顯微鏡觀察條件復(fù)制型溶瘤腺病毒Ad-MK作用于膀胱癌細(xì)胞

11、后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。采用MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))比色法檢測Ad-MK聯(lián)合絲裂霉素后對(duì)膀胱癌細(xì)胞BIU-87的作用,通過計(jì)算相互作用指數(shù)CDI數(shù)值觀察兩者聯(lián)合是否有協(xié)同作用。細(xì)胞存活率檢測Ad-MK對(duì)膀胱癌細(xì)胞BIU-87放射敏感性的影響。通過病毒復(fù)制量的測定觀察外照射及絲裂霉素對(duì)溶瘤腺病毒Ad-MK在膀胱癌細(xì)胞BIU-87中復(fù)制的影響。 結(jié)果:淺表型和惡性浸潤性膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株BIU-87、EJ中均可見MK mRNA的表達(dá)。

12、條件復(fù)制型溶瘤腺病毒Ad-MK作用于BIU-87細(xì)胞后,引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。細(xì)胞變圓,膨脹,懸浮,胞漿中出現(xiàn)空泡。之后細(xì)胞裂解。其形態(tài)學(xué)改變有時(shí)間性變化。最后細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。Ad-MK感染BIU-87細(xì)胞后,RT-PCR可檢測到細(xì)胞中Ela mRNA的表達(dá)。Ad-MK對(duì)BIU-87細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的量效、時(shí)效關(guān)系。隨著濃度的增加及時(shí)間的延長對(duì)細(xì)胞的抑制作用逐漸增加。與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ad-MK聯(lián)合

13、低劑量絲裂霉素(50μg/L)后對(duì)BIU-87細(xì)胞生長的抑制作用明顯增加,與單用Ad-MK或MMC組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。數(shù)據(jù)分析顯示CDI<1,則表示兩者聯(lián)合使用對(duì)BIU-87細(xì)胞有協(xié)同作用。4Gy照射BIU-87細(xì)胞的存活率為0.11±0.013,0.1MOI Ad-MK處理BIU-87細(xì)胞的存活率為0.13±0.004,4Gy聯(lián)合0.1MOIAd-MK后細(xì)胞存活率為0.003±0.002。聯(lián)合組細(xì)胞的存活率與單用

14、Ad-MK或放療相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。通過對(duì)病毒復(fù)制量的測定發(fā)現(xiàn)低劑量放療和MMC聯(lián)合病毒治療后,并未減少病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。與單獨(dú)病毒感染組相比,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論:淺表型和惡性浸潤性膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株BIU-87、EJ兩種細(xì)胞系中均有MK mRNA的表達(dá);采用RT-PCR技術(shù)可檢測到受病毒感染的細(xì)胞中有病毒Ela mRNA的表達(dá),說明Ad-MK在膀胱癌細(xì)胞中進(jìn)行了復(fù)制。這個(gè)結(jié)果

15、也提示,在形態(tài)學(xué)觀察和MTT實(shí)驗(yàn)中觀察到的Ad-MK對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用是由于病毒在細(xì)胞中選擇性復(fù)制引起的。條件復(fù)制型溶瘤腺病毒Ad-MK對(duì)膀胱癌細(xì)胞BIU-87細(xì)胞的增殖抑制作用呈量效和時(shí)效關(guān)系。放療和絲裂霉素能增強(qiáng)Ad-MK的細(xì)胞毒作用,并能增加病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。 第三部分膀胱移行細(xì)胞癌中MK蛋白表達(dá)與其對(duì)應(yīng)的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 目的:研究中期因子(midkine,MK)在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá),探討其

16、與膀胱癌對(duì)應(yīng)的臨床病理特征及與術(shù)后患者預(yù)后的關(guān)系,探討該因子成為膀胱癌分子標(biāo)志物、預(yù)后分析指標(biāo)及靶向治療靶點(diǎn)的可能性。 方法:采用SP免疫組化染色法檢測50例手術(shù)切除的人膀胱移行細(xì)胞癌組織和10例正常膀胱粘膜中MK蛋白的表達(dá),分析MK蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與其臨床對(duì)應(yīng)的各項(xiàng)病理參數(shù)的關(guān)系,對(duì)其中40例有隨訪資料者的MK蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果:MK蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。在人

17、膀胱移行細(xì)胞癌組織中MK蛋白的表達(dá)率為90%(45/50),在正常膀胱組織中無表達(dá)或弱表達(dá);膀胱移行細(xì)胞癌中隨腫瘤浸潤深度和分級(jí)的增加,MK蛋白的表達(dá)逐步增強(qiáng)(P值分別為0.043、0.003)。而MK蛋白表達(dá)與性別、腫瘤大小、數(shù)目、初復(fù)治無相關(guān)(P值分別為0.466、0.229、0.837、0.785)。生存分析表明MK蛋白低表達(dá)組1、3、5年生存率分別81.8%、81.8%、72.7%,MK蛋白高表達(dá)組1、3、5年生存率分別63.6

18、%、36.4%、18.2%,MK蛋白低表達(dá)組生存率顯著低于高表達(dá)組,兩組間生存率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論:MK蛋白在人膀胱移行細(xì)胞癌組織中高表達(dá),在正常膀胱粘膜上皮無或弱表達(dá)。MK蛋白表達(dá)隨腫瘤分期和分級(jí)的增加表達(dá)逐步增強(qiáng),而與患者性別、年齡、腫瘤大小、數(shù)目、初復(fù)治無相關(guān)。MK蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌術(shù)后患者的預(yù)后相關(guān),MK蛋白呈高表達(dá)者的生存時(shí)間比低表達(dá)者短。因此MK有可能成為膀胱移行細(xì)胞癌有價(jià)值的分子標(biāo)志

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