以AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒的方法學(xué)改進(jìn).pdf

1、目的:腺病毒AdEasy系統(tǒng)是一種利用原核細(xì)胞完成重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒之間的同源重組,快速構(gòu)建重組腺病毒的好方法.我們將其中的某些步驟進(jìn)行了改進(jìn),以獲得一種更加高效、簡(jiǎn)便、快速構(gòu)建重組腺病毒的方法.方法:我們將腺病毒骨架載體pAdEasy-1通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗性篩選、酶切鑒定獲得含pAdEasy-1的E.coli BJ5183/p菌種,并鑒定其穩(wěn)定性.隨后用CaCl<,2>法制備E.col

2、i BJ5183/p感受態(tài)細(xì)胞.并轉(zhuǎn)化含GFP的腺病毒穿梭質(zhì)粒,利用E.coli BJ5183細(xì)胞內(nèi)同源重組機(jī)制獲得重組腺病毒質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定并確定重組的位置.與常規(guī)的共轉(zhuǎn)化方法相比較,了解這種方法的重組效率.將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞,獲得高拷貝的重組質(zhì)粒.以Pac I酶切,獲得重組腺病毒DNA分子,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒.感染原代血吸蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行腺病毒嗜性的初