腺病毒快速濃縮與純化方法的建立和溶菌酶與γ干擾素共表達重組腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、腺病毒(adenovirus，Ad)載體具有感染宿主范圍廣、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高和不易引起插入突變等優(yōu)點，因此廣泛應(yīng)用作基因治療和基因工程疫苗的載體，但現(xiàn)有的重組腺病毒制備方法具有費時、成本高、不易規(guī)模化等缺點。受體結(jié)合捕獲（receptor-binding capture）技術(shù)能從組織和環(huán)境樣品中濃縮病毒，將其與PCR等技術(shù)相結(jié)合可用于病毒的濃縮和環(huán)境監(jiān)測。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)是一種人工合成

2、的蛋白聚合物，具有溫度敏感相變特性，即隨著溶液溫度的變化由可溶性狀態(tài)變?yōu)椴豢扇苣蹱顟B(tài)，已廣泛用作重組蛋白的純化標簽。將ELP的溫度敏感相變特性與柯薩奇病毒-腺病毒受體(coxsachievirusand adenovirus receptor，CAR)結(jié)合腺病毒的特異性相結(jié)合，用重組大腸桿菌表達的ELP-CAR融合蛋白有望建立簡單、快速、經(jīng)濟的腺病毒濃縮與純化方法。
　　奶牛乳房炎嚴重地制約著奶牛業(yè)的發(fā)展，目前一般采用抗生素防治

3、。但奶牛乳房炎的病原種類復(fù)雜，中小型奶牛場一般不進行病原菌鑒定和藥物敏感性檢測，長期、盲目使用抗生素不僅治療效果不佳，而且藥物殘留和耐藥菌株日益嚴重。溶菌酶是一種細胞壁溶解酶，對多種革蘭氏陽性菌具有直接溶菌作用，在補體等體液因子參與下對革蘭氏陰性菌也有一定的溶菌作用，表達溶菌酶的重組質(zhì)粒對奶牛乳房炎具有良好的防治效果。γ干擾素（IFN-γ）是一種高活性、多功能細胞因子，能提高機體的免疫和抗感染能力，重組大腸桿菌表達的牛γ干擾素對奶牛乳房

4、炎也有一定的治療效果。因此，溶菌酶與BoIFN-γ，共表達重組腺病毒對奶牛乳房炎可能具有更好的治療效果。
　　一、ELP-CAR融合蛋白的表達與純化:依次將ELP、CAR間隔區(qū)和CAR D1區(qū)編碼序列插入原核表達載體pET-30a，將重組質(zhì)粒pET-ELP-CAR轉(zhuǎn)化BLR(DE3)大腸桿菌，在20℃利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達，在優(yōu)化條件下利用ELP的溫度敏感逆向相變循環(huán)(ITC)純化融合蛋白。結(jié)果顯示:ELP-CAR融合蛋白在

5、重組大腸桿菌中獲得可溶性表達，第一輪逆向相變循環(huán)獲得的融合蛋白純度為89.4％，再次逆向相變循化后的純度達94.5％。Western-blot鑒定結(jié)果顯示:純化的ELP-CAR融合蛋白能被CAR抗體識別。這些實驗結(jié)果表明，本研究成功純化出了ELP-CAR融合蛋白。
　　一、腺病毒快速濃縮與純化方法的建立:將rAd-GFP與ELP-CAR融合蛋白混合，4℃孵育1h后用ITC沉淀，經(jīng)PCR檢測證明rAd-GFP能被ELP-CAR融合蛋

6、白結(jié)合和沉淀。將不同濃度ELP-CAR融合蛋白與rAd-GFP在不同溫度、pH條件下孵育不同時間，用ITC回收結(jié)合的rAd-GFP，病毒滴定結(jié)果顯示120mg/ml的ELP-CAR與rAd-GFP在18℃、pH7.0孵育30min的結(jié)合效率最佳。將結(jié)合融合蛋白的rAd-GFP在不同溫度、pH條件下洗脫不同時間，病毒滴定結(jié)果顯示最佳洗脫條件為20℃、pH9.0、10min。在優(yōu)化條件下分別從rAd-GFP感染細胞培養(yǎng)上清和裂解細胞中純化重

7、組腺病毒，結(jié)果顯示rAd-GFP的獲得率分別為76.2％和73.3％。在優(yōu)化條件下洗脫從rAd-GFP感染細胞培養(yǎng)上清和裂解細胞純化的rAd-GFP，結(jié)果顯示回收率分別30.6％和34.5％，與高壓液相色譜和氯化銫密度梯度的回收率相當。分別用結(jié)合ELP-CAR融合蛋白和洗脫的rAd-GFP感染CAR陽性PK-15細胞、CAR弱陽性CHO-K1細胞和CAR陰性NIH3T3細胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示洗脫和未洗脫重組腺病毒均能感染PK-15

8、和CHO-K1細胞，不能感染NIH3T3細胞。用含或不含10％犢牛血清的細胞培養(yǎng)液稀釋洗脫和未洗脫重組腺病毒，分別感染PK-15和CHO-K1細胞，流式細胞儀計數(shù)結(jié)果表明洗脫和未洗脫重組腺病毒均能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15細胞，而且受犢牛血清的影響較小;對于CHO-K1細胞，洗脫腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于未洗脫重組腺病毒，而且受犢牛血清的影響較大。將不同濃度rAdv-GFP接種自來水和PBS，然后加入ELP-CAR融合蛋白，孵育一定時間后用ITC

9、回收，熒光定量PCR檢測結(jié)果表明ELP-CAR融合蛋白從PBS和自來水中捕獲病毒的效率分別為74％和63％。
　　三、雙表達腺病毒載體的構(gòu)建:用化學(xué)合成或PCR擴增腦心肌炎病毒(EMCV)、Gtx同源異型蛋白(Gtx)、人蛋白翻譯起始因子4G(EIF4G)、人膠原誘導(dǎo)蛋白(hVCIP)和鼠膠原誘導(dǎo)蛋白(mVCIP)的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，測序鑒定正確后分別插入腺病毒載體pShuttle-CMV，構(gòu)建獲得雙表達腺病毒載體p

10、Shuttle-IRES。分別以含人溶菌酶(hLYZ)和綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組質(zhì)粒為模板，用PCR擴增LYZ和GFP基因，分別插入pShuttle-IRES載體IRES位點的上游和下游，獲得5種重組載體pShuttle-LYZ-IRES-GFP。分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將5種重組載體轉(zhuǎn)染PK15、AAV-293、CHO-K1和MDBK細胞，用流式細胞術(shù)等檢測GFP陽性細胞及熒光強度，結(jié)果表明EIF4GIRES能在四種不同細胞中有效表

11、達下游GFP基因。
　　四、溶菌酶與γ干擾素共表達重組腺病毒的制備及表達檢測:根據(jù)BoIFN-γ編碼序列設(shè)計引物，兩端分別引入XhoI、HindⅢ酶切位點，以pGEX-IFNγ質(zhì)粒為模板PCR擴增BoIFN-γ序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ酶切消化后，取代pShuttle-LYZ-EIRES-GFP中的GFP編碼序列，獲得共表達重組腺病毒載體pShuttle-LYZ-EIRES-IFNγ，用常規(guī)構(gòu)建方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得同源