人PDCD4啟動子的確定及其轉錄調(diào)控的初步研究.pdf

1、目的:
　　 程序性細胞死亡，又稱為細胞凋亡，在生物體發(fā)育過程中具有很重要的作用。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)最初是在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的在細胞凋亡中表達上調(diào)的基因，后來陸續(xù)在雞、大鼠、人類中發(fā)現(xiàn)給基因的同源物。目前對于該基因在細胞凋亡中所起到的具體作用和機制尚不清楚。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，目前的證據(jù)說明PDCD4是一個新的抑癌基因，可以作為一個抗

2、腫瘤治療中潛在的靶基因。
　　 方法:
　　 一、人PDCD4啟動子全長的克隆及其啟動活性的分析。
　　 1、人PDCD4啟動子區(qū)的預測；
　　 為了克隆PDCD4的啟動子，首先利用MatInspector、FirstEF、ProscanPrediction軟件對人PDCD4基因5’端-2500～+500段（轉錄起始位點為+1）進行啟動子區(qū)預測。
　　 2、人PDCD4啟動子區(qū)克隆及報告質粒構建、

3、鑒定；
　　 結合啟動子預測結果，選定長898bp的-548～+350片段，設計合適的引物，同時引入酶切位點KpnⅠ、BglⅡ，以人基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物雙酶切后克隆入pGL4-Basic相應酶切位點，構建pGL4-PDCD4-P1，測序分析。
　　 3、RT-PCR和Western blotting檢測內(nèi)源性PDCD4在卵巢癌細胞系中的表達；
　　 為了在細胞中檢測PDCD4啟動子的活性，

4、我們分別采用RT-PCR和WesternBlot法從RNA和蛋白質水平檢測了PDCD4在4種卵巢癌細胞系中的表達狀態(tài)，以篩選適合的細胞模型。
　　 二、PDCD4核心啟動子的確定。
　　 1、以pGL4-PDCD4-P1為模板構建一系列PDCD4-P1截短載體
　　 為了確定PDCD4核心啟動子，對PDCD4-P1進行一系列截短。分別選定PDCD4基因-315～+350、+10～+350、-315～+1、-164

5、～+1、-114～+1、-67～+1片段，以pGL4-PDCD4-P1為模板，PCR擴增，命名為P2 P3 P4 P5 P6 P7，亞克隆入pGL4-Basic載體構建相應截短載體。
　　 2、報告質粒的轉染及雙熒光活性分析
　　 將上述構建的報告質粒及pGL4-Basic（陰性對照）分別與pRL-TK（內(nèi)參照）瞬時共轉染卵巢癌細胞系OVCAR3、SKOV3，方法同上，每種質粒設2復孔，同一轉染實驗至少重復3次。

6、　　 三、人PDCD4的轉錄調(diào)控。
　　 1、人PDCD4啟動子區(qū)轉錄因子結合位點的預測與分析
　　 為了研究PDCD4轉錄調(diào)控機制，利用MatInspector軟件對人PDCD4基囚5’端-600～+400區(qū)進行轉錄因子結合位點分析
　　 2、PDCD4啟動子截短載體的構建與雙熒光素酶活性的檢測
　　 為了研究PDCD4轉錄起始位點下游轉錄調(diào)控區(qū)，對PDCD4啟動子區(qū)3’端進行截短，選定-548～+2

7、23、-315～+223片段，分別以pGL4-PDCD4-P1、P2為模板，PCR擴增，命名為PDCD4-P8、P9，克隆入pGL4-Basic載體構建pGL4-PDCD4-P8、P9，雙酶切、測序鑒定。
　　 將上述構建的重組質粒和pGL4-Basic-P1、P2進行雙熒光素酶檢測，方法同上。每種質粒設2復孔，同一轉染實驗至少重復3次。
　　 3、構建PDCD43’端RREB結合位點截短載體以及RREB結合位點突變報告

8、載體并進行雙熒光素酶活性檢測。
　　 結果：
　　 一、人PDCD4啟動子全長的克隆及其啟動活性的分析。
　　 1、軟件預測初步確定了人PDCD4可能的啟動子區(qū)；
　　 為了確定PDCD4的啟動子，我們用三個軟件對其進行了預測。在線軟件MatInspector分析結果顯示，-500～+191段為PDCD4啟動子區(qū)，該區(qū)域含有4個轉錄因子SP1結合位點；FirstEF預測結果顯示-262～+307段為啟動子

9、區(qū)；Proscan Prediction軟件預測結果顯示+25～+275段位啟動子區(qū)。綜合上述三個軟件的分析結果，最終選定了包含所有預測結果的-548～+350段為假定人PDCD4啟動子區(qū)，命名為PDCD4-P1。
　　 2、人PDCD4啟動子區(qū)的克隆及報告質粒pGL4-PDCD4-P1構建、鑒定
　　 為了獲得PDCD4啟動子區(qū)PDCD4-P1，我們以正常人基因組DNA為模板，利用特異性引物對PDCD4-548～+35

10、0段進行PCR擴增，電泳結果顯示一條PDCD4-P1(898bp)的特異DNA片段，目的片段電泳回收后，經(jīng)KpnI、BglⅡ雙酶切，連接至pGL4-Basic載體的KpnⅠ、BglⅡ酶切位點間，連接產(chǎn)物經(jīng)轉化以及LA平板篩選后挑取單克隆菌落，堿變性法抽提重組質粒。
　　 3、不同卵巢癌細胞系PDCD4的表達情況。
　　 為了找到合適的細胞模型，檢測了不同卵巢癌細胞系PDCD4的表達情況。RT-PCR結果顯示OVCAR3細

11、胞系中PDCD4 mRNA表達較高，而其它三種細胞系低表達PDCD4 mRNA; Western blot結果顯示OVCAR3細胞系高表達PDCD4蛋白，而SKOV3、CAOV3和3AO細胞系中PDCD4陽性條帶亮度明顯較弱。
　　 4、報告質粒pGL4-PDCD4-P1雙熒光活性分析。
　　 雙熒光素酶分析證實，pGL4-PDCD4-P1在OVCAR3，SKOV3細胞系中均具有啟動子活性，其M1/M2比值分別為pGL4

12、-Basic空載體的67倍和15倍。其中，在高表達內(nèi)源性PDCD4的OVCAR3細胞中，PDCD4-P1啟動子活性明顯高于低表達PDCD4的SKOV3細胞。該部分結果說明，PDCD4-P1已經(jīng)包含具有啟動活性的區(qū)段，PDCD4啟動子克隆成功。
　　 二、PDCD4核心啟動子的確定。
　　 1、PDCD4-P1一系列截短片段的重組報告質粒構建成功；
　　 為了確定PDCD4核心啟動子，對PDCD4-P1進行一系列截

13、短。分別選定PDCD4基因-315～+350、+10～+350、-315～+1、-164～+1、-114～+1、-67～+1片段，以pGL4-PDCD4-P1為模板，PCR擴增，命名為P2 P3 P4 P5 P6 P7，電泳結果均與預測相符。
　　 2、報告質粒的雙熒光活性分析及PDCD4核心啟動子區(qū)的確定。
　　 雙熒光素酶結果顯示，上述重組報告質粒在轉染PDCD4高表達的OVCAR3細胞系后，P2(-315～+350

14、)、P4(-315～+1)、P5(-164～+1)均具有較強的啟動子活性，約為pGL4-Basic空載體的40倍左右，隨著PDCD45’端的截短，P6(-114～+1)啟動子活性開始下降，約為空載體的13倍，當截短到-67位點時，P7(-67～+1）啟動活性完全喪失。
　　 三、人PDCD4轉錄調(diào)控的初步研究。
　　 1、結合PDCD4啟動子區(qū)轉錄因子的分析及預測；
　　 利用在線軟件MatInspector分析

15、PDCD45’端轉錄因子結合位點，發(fā)現(xiàn)PDCD4核心啟動子區(qū)(-164～-67段)發(fā)現(xiàn)3個潛在的SP1結合位點(-151、-145、-72)，此外PDCD4核心啟動子兩側存在若干個重要的轉錄因子結合位點，以下為部分分析參數(shù)高于0.90并且參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的TFBSs:NF-kB(-445)、RREB(-153)、IRFF(+66)、RREB(+239)、RREB(+283)、RREB(+293)。
　　 2、SP1對PDCD4轉

16、錄活性的影響。
　　 轉錄因子SP1通常負責維持PDCD4的基礎水平轉錄，我們在PDCD4核心啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個SP1結合位點(-151、-145、-72)，結合前期截短實驗結果，我們發(fā)現(xiàn)，PDCD4-P5(-164～+1)具有較強的啟動子活性，隨著PDCD45’端的截短，去除了兩個Sp1結合位點(-151、-145)的P6(-114～+1)啟動子活性開始下降，約為空載體的13倍，當截短到-67位點使3個Sp1結合位點均缺失后，

17、P7(-67～+1)啟動活性完全喪失。提示3個SP1有可能共同負責維持PDCD4的基礎水平轉錄。
　　 3、NF-kB對PDCD4轉錄活性的影響。
　　 為了研究NF-kB對PDCD4轉錄活性的影響，我們通過對PDCD4啟動子的截短而去除NF-kB結合位點，雙熒光素酶檢測其對PDCD4啟動活性的影響。
　　 4、成功構建PDCD4啟動子3’端系列截短載體以及定點突變報告載體。
　　 為了研究PDCD4轉錄

18、調(diào)控機制，設計特異性引物對軟件預測的PDCD4轉錄因子密集的區(qū)域進行截短，構建重組報告質粒。酶切、測序結果均證實重組截短載體pGL4-PDCD4-P8(-548～+223)、pGL4-PDCD4-P9(-315～+223)、pGL4-PDCD4-P10(-315～+292)和定點突變載體pGL4-PDCD4-P1-RREB3mut構建成功。
　　 結論：
　　 1.本實驗成功構建了一系列含人PDCD4啟動子的螢火蟲熒光素