某些裂殖酵母核糖體基因和非核糖體基因的鄗除及表型比較研究.pdf

1、核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)是組成核糖體的重要單位，其主要功能是參與核糖體的組裝和蛋白質(zhì)的翻譯。核糖體由大量核糖體蛋白以及核糖體RNA(rRNA)在核仁中組裝完成。大約有150種rRNA基因和137種核糖體蛋白編碼基因作為候選完成基因轉(zhuǎn)錄這一巨大的工程。本實驗室前期已成功敲除核糖體蛋白基因L32-7和L32-2，并發(fā)現(xiàn)敲除菌株在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，出現(xiàn)數(shù)以百計的細(xì)胞凝集在一起形成肉眼可見細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞凝絮現(xiàn)

2、象(flocculation)。為進(jìn)一步了解引起酵母細(xì)胞絮凝的原因，本文在此基礎(chǔ)上，通過查閱文獻(xiàn)(Anabelle Decottigrnies et al.，2003)，從敲除不引起致死的酵母基因中隨機選擇敲除核糖體蛋白基因L21-2和L9-2以及非核糖體蛋白基因SPBC1347.09，SPAC732.02c，SPBC73G7.02，sck1。通過PCR獲得敲除片段的上下游基因及篩選抗性基因KanMX6，最后將三片段同時加入PCR管中，

3、用同源臂的上游P1和下游P2通過PCR獲得全長的敲除片段。應(yīng)用Li-Ac轉(zhuǎn)化法，將敲除片段導(dǎo)入受體菌SP-Q01，YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)之后涂G418抗性平板，篩選陽性克隆。對陽性克隆提取基因組PCR驗證，保存驗證正確的陽性菌株。通過對這六株基因敲除菌株的培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)的觀察和生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)敲除核糖體蛋白基因的菌株長勢緩慢，且都有細(xì)胞凝絮現(xiàn)象；而敲除非核糖體蛋白基因的菌株則無此現(xiàn)象。到此我們可以初步判斷裂殖酵母細(xì)胞核糖體蛋白表達(dá)水平