小鼠巨細胞病毒感染對乳鼠海馬突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白的影響研究.pdf

1、第一部分 MCMV 感染對乳鼠海馬突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白的影響
　　 目的：研究MCMV 感染對乳鼠海馬神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白表達的影響。
　　 方法：①體外細胞培養(yǎng)法傳毒增殖MCMV Smith 毒株，Reed-Muench 法計算病毒毒力。②建立乳鼠腦組織MCMV 感染模型：ELISA 法篩選MCMV IgM和IgG 均為陰性的BALB/C 小鼠，雌雄小鼠同籠受孕。仔鼠出生當天，按窩隨機分為實驗組和對照組。實驗

2、組（n=90）顱內(nèi)接種MCMV 病毒懸液10μl，對照組（n=90）顱內(nèi)接種等量的細胞維持液。無菌采集接種后3d、15d、30d 腦組織各30只，應(yīng)用PCR法檢測其MCMV 感染情況，實驗組內(nèi)MCMV DNA陽性以及對照組內(nèi)MCMV DNA陰性腦組織用于后續(xù)試驗。③應(yīng)用免疫熒光標記SYP，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組乳鼠海馬SYP 熒光顆粒數(shù)目，以此代表突觸數(shù)目。④應(yīng)用Real-time qPCR、免疫組織化學(xué)方法及Western b

3、lot 法檢測各組乳鼠海馬突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2 亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平。
　　 結(jié)果：MCMV ① Smith 毒株的TCID50 為10-4.5/0.1ml。②實驗組小鼠腦組織中均可檢見MCMV DNA，對照組小鼠腦組織中未檢見MCMV DNA。③隨日齡增加，兩組乳鼠海馬SYP 熒光顆粒數(shù)目不斷增加；與對照組比較，實驗組各時相乳鼠海馬SYP熒光顆粒數(shù)目均減少，其中第15d和第

4、30d 減少更為明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。④
　　 隨日齡增加，兩組乳鼠海馬SYP、PSD-95及AMPA 受體GluR2 亞基編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平均不斷增高；與對照組比較，實驗組各時相三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平均降低，其中，第15d和第30d下降更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：①MCMV 感染可導(dǎo)致發(fā)育中的乳鼠海馬突觸形成數(shù)目減少，并且隨著日齡的增加，其影響更為明顯。②MCMV 可

5、導(dǎo)致發(fā)育過程中的乳鼠突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA 受體GluR2 亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平下降。
　　 第二部分 MCMV 感染后星形膠質(zhì)細胞分泌產(chǎn)物對神經(jīng)元突觸的影響
　　 目的：研究MCMV 感染后星形膠質(zhì)細胞分泌產(chǎn)物對神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白表達的影響。
　　 方法：①建立星形膠質(zhì)細胞MCMV感染模型：原代及傳代培養(yǎng)乳鼠海馬星形膠質(zhì)細胞；應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法檢測星形膠質(zhì)細胞特

6、異性標記物GFAP的表達情況，鑒定并檢測星形膠質(zhì)細胞的純度；以100TCID50 MCMV攻擊星形膠質(zhì)細胞后，通過PCR檢測MCMV DNA、觀察細胞培養(yǎng)液對NIH 3T3細胞的細胞毒作用、CCK-8法檢測MCMV對星形膠質(zhì)細胞存活率的影響，以及繪制MCMV在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的生長曲線等方法，判定星形膠質(zhì)細胞對MCMV的易感性、感染狀態(tài)以及MCMV在細胞內(nèi)的生長情況。②建立星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液（Astrocyte conditioned m

7、edium，ACM）與神經(jīng)元共培養(yǎng)體系：原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元；應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法檢測神經(jīng)元特異性標記物NSE的表達情況，鑒定并檢測神經(jīng)元的純度；以100TCID50 MCMV攻擊傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，收集MCMV感染后6、12、24、48、72h以及相同時間點的對照組ACM，過濾及離心后用紫外燈照射15min滅活CMV；應(yīng)用CCK-8法檢測不同濃度ACM對神經(jīng)元存活的影響，以確定最佳的ACM濃度應(yīng)用于后續(xù)實驗；根據(jù)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)液

8、各組分不同，分為實驗組（含最佳濃度的各不同時間點感染ACM）、ACM對照組（含最佳濃度的各不同時間點正常ACM）及空白對照組（不含ACM）。③應(yīng)用免疫熒光標記SYP，并在熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元突觸數(shù)目，以此代表突觸數(shù)目。④應(yīng)用Real-time qPCR及免疫細胞化學(xué)方法檢測各組神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平。
　　 結(jié)果：①體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞（純度達9

9、5％以上）感染MCMV后發(fā)生典型細胞病變；在MCMV 感染48h的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)可以檢測到MCMV IE DNA的表達；
　　 感染后3d~4d的ACM 可使NIH 3T3細胞發(fā)生典型的CMV 病毒蝕斑；星形膠質(zhì)細胞在感染MCMV后24h 開始死亡，感染后72h 大部分細胞死亡，至感染后96h細胞幾乎全部死亡；MCMV在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的復(fù)制于感染后12h 開始增高，72h 達到高峰。
　　 ②體外培養(yǎng)神經(jīng)元的純度可達98

10、％以上，培養(yǎng)基含50％ACM 時神經(jīng)元存活率最高。
　　 ③與空白對照組相比，ACM 對照組和實驗組12h~72h SYP 熒光顆粒數(shù)目均明顯增多（P<0.01）；與ACM 對照組比較，實驗組12h~72h SYP 熒光顆粒數(shù)目均明顯減少（P<0.01）。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，ACM 對照組12h、24h、48h SYP 熒光顆粒數(shù)目均比前一時相明顯升高（P<0.01），72h 變化不明顯（P>0.05）；實驗組僅12h SYP 熒光顆

11、粒數(shù)比前一時相明顯升高（P<0.01），24h、48h、72h 變化不明顯（P>0.05）。④與空白對照組比較，ACM 對照組和實驗組12~72h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平均顯著升高（P<0.01）。與ACM 對照組比較，實驗組12~72h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平均顯著降低（P<0.01）。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，ACM 對照組12h、24h、48h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平均比前一時相明顯

12、升高（P<0.01），72h 變化不明顯（P>0.05）；實驗組僅12h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達水平均比前一時相明顯升高（P<0.0.1），24h、48h、72h 變化不明顯（P>0.05）。
　　 結(jié)論：①MCMV 可在傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)復(fù)制、產(chǎn)毒并產(chǎn)生致細胞病變效應(yīng)。②星形膠質(zhì)細胞分泌物可促進突觸形成，MCMV 可能通過影響星形膠質(zhì)細胞的合成及分泌功能而使突觸形成減少。③星形膠質(zhì)細胞分泌物可促進神經(jīng)元突

13、觸相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達，MCMV 可能通過影響星形膠質(zhì)細胞分泌功能而干擾神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達。
　　 第三部分 MCMV 感染對星形膠質(zhì)細胞合成分泌TSP-1 及TNF-α的影響
　　 目的：研究MCMV 對星形膠質(zhì)細胞合成分泌TSP-1 及TNF-α的影響。
　　 方法：傳代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，分為實驗組和對照組。實驗組加入100 TCID50MCMV 及細胞維持液，對照組加

14、入細胞維持液。收集6、12、24、48、72h的細胞和ACM，ACM 過濾及離心后用紫外燈照射15min 滅活CMV。①應(yīng)用Real-time qPCR及免疫細胞化學(xué)方法檢測MCMV 感染對星形膠質(zhì)細胞TSP-1、TNF-αmRNA 及蛋白質(zhì)表達水平的影響。②應(yīng)用ELISA 法檢測MCMV 感染對星形膠質(zhì)細胞分泌TSP-1 及TNF-α的影響。
　　 結(jié)果：①與對照組比較，實驗組各時相TSP-1 及TNF-αmRNA 及蛋白質(zhì)表

15、達水平均降低（P 均<0.01）；感染時間越長，表達水平越低，差異越大。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，感染組12h~72h表達水平均低于前一時相（P 均<0.05）。②星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)12h后才能在ACM中檢測到TSP-1 及TNF-α；對照組TSP-1 及TNF-α含量在48h 內(nèi)迅速升高（與前一時相比較，P 均<0.05），72h 升高速度減慢；與對照組比較，實驗組各時相TSP-1 及TNF-α含量均減少（P 均<0.01），且12h~72h 含量