APP廣東分離株生物學(xué)特性研究及其apxⅡ C基因缺失重組載體的構(gòu)建.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的豬的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 本論文主要是研究傳染性胸膜肺炎放線桿菌廣東分離株的生物學(xué)特性，初步建立了一套豬傳染性胸膜肺炎的PCR檢測(cè)方法，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建apxⅡ C基因缺失的胸膜肺炎放線

2、桿菌突變載體，為減毒活疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 1．胸膜肺炎放線桿菌的生物學(xué)特性的研究對(duì)胸膜肺炎放線桿菌血清1型廣東分離株進(jìn)行了培養(yǎng)特性的觀察，“衛(wèi)星”現(xiàn)象、CAMP試驗(yàn)及糖發(fā)酵、尿素酶試驗(yàn)均符合豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的生物學(xué)特性。對(duì)培養(yǎng)基中不同的NAD和小牛血清對(duì)APP生長(zhǎng)的影響的研究結(jié)果表明，APP在含有8.0％小牛血清和5μg/mL NAD的TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好。利用濁度測(cè)定對(duì)APP 1型菌在TSB的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定，發(fā)

3、現(xiàn)其在24h進(jìn)入穩(wěn)定期。而且，APP 1型菌在TSB中的生長(zhǎng)具有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可用于APP的攻毒試驗(yàn)。致病性試驗(yàn)表明，APP 1型廣東分離株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為1.14×10<'9> CFU。 2．基于apxⅣ A基因的PCR檢測(cè)方法的初步建立根據(jù)GenBank上公布的豬胸膜肺炎放線桿菌的apxⅣ A基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，初步建立了豬傳染性胸膜肺炎的PCR診斷方法。以胸膜肺炎放線桿菌血清1型和7型標(biāo)準(zhǔn)菌株、本研究所分離的

4、APP，實(shí)驗(yàn)室保存的巴氏桿菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，APP標(biāo)準(zhǔn)株、分離菌株均檢測(cè)到apxⅣ A基因，擴(kuò)增出的特異片段大小約400bp，而其它對(duì)照菌均未檢出。 3．重疊延伸PCR方法構(gòu)建apxⅡ C突變載體PBS-CA(-)胸膜肺炎放線桿菌毒素apxⅡ CA基因由激活基因apxⅡ C和結(jié)構(gòu)毒素基因apxⅡ A組成，apxⅡ C基因失活后突變株的毒力大大降低，但并不影響結(jié)構(gòu)毒素蛋白ApxⅡ A的分泌表

5、達(dá)。本研究采用PCR從本室分離鑒定的APP野毒株血清1型基因組DNA中擴(kuò)增最主要的毒素蛋白編碼基因apxⅡ CA并進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)BLAST比較，與國(guó)外APP血清1，2，3和7型菌株apx Ⅱ CA基因在核苷酸上同源性達(dá)99％以上。 通過(guò)重疊延伸PCR方法將apxⅡ C基因缺失，并將該DNA片段克隆到PBS-T載體中構(gòu)建了apxⅡ C基因失活的轉(zhuǎn)移載體pBSCA(-)。 4．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體PBSCA(-)OSA的構(gòu)