致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的部分生物學(xué)特性研究.pdf

1、本文進(jìn)行了如下研究： 1、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的分離鑒定 對(duì)臨床鵝卵黃性腹膜炎病例進(jìn)行了細(xì)菌分離，染色鏡檢、形態(tài)觀察、糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)、TSI斜面接種試驗(yàn)和O抗原血清凝集試驗(yàn)等傳統(tǒng)細(xì)菌分類鑒定，在此基礎(chǔ)上擴(kuò)增了E0238、E0239、E0240三個(gè)菌株的16S rDNA，通過測(cè)序和序列分析，證明獲得的7株細(xì)菌為大腸桿菌，編號(hào)為E0238、E0239、E0240、E0453、E0454、E0241、E024

2、5,其血清型分別為O2、O21、O37、O1、O24、O24、O148。 2、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌毒力相關(guān)基因檢測(cè) 根據(jù)網(wǎng)上已經(jīng)公布的大腸桿菌毒力相關(guān)基因的序列，設(shè)計(jì)引物，以致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238、E0239、E0240為試驗(yàn)對(duì)象，用PCR方法檢測(cè)其毒力相關(guān)基因。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所檢測(cè)的11個(gè)毒力相關(guān)基因中，三株致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的fimC基因均為陽性，且均未檢測(cè)到hlyE和tsh基因，其中E0

3、239(血清型O21)具有九種毒力基因(fimC-papC-fyuA-irp2-aer-iss-colV-vat-stx2f)，而E0238(血清型O2)、E0240(血清型O37)兩株細(xì)菌只檢測(cè)到了fimC基因的存在。提示Ⅰ型菌毛等基因可能與致鵝卵黃性腹膜炎有一定關(guān)系。 3、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌Ⅰ型菌毛fimFGH基因的序列分析 根據(jù)Genbank公布的fimFGH序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)3株致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E

4、0238、E0239、E0240的Ⅰ型菌毛fimFGH基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。序列分析結(jié)果表明，fimF、fimG、fimH基因及其所編碼蛋白與Genbank中相關(guān)序列的同源性很高(同源性>96％)，其中以基因fimH及其編碼蛋白的保守性最高(同源性>98％)，部分達(dá)到100％。研究發(fā)現(xiàn)FimH蛋白的主要變異集中分布在FimH粘附素N末端的4個(gè)氨基酸位點(diǎn)(N91S99→S91N99或N91N99；A48→V48；N156→K1

5、56即成熟FimH蛋白的N70S78→S70N78或S70N78；A27→V27；N135→K135)，本研究中在這4個(gè)氨基酸位點(diǎn)中僅有E0239菌株發(fā)生了變異(A48→V48即成熟蛋白A27→V27)；FimF、FimG蛋白各有一個(gè)多變區(qū)域，分別位于111～124位氨基酸位點(diǎn)之間和4～16位氨基酸位點(diǎn)之間，其中E0238、E0239菌株FimF蛋白發(fā)生了A111→S111的變異，E0238、E0240菌株FimG蛋發(fā)生了C4V9→R4

6、L9的變異，但其變異的具體意義需更進(jìn)一步研究證實(shí)。 4、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌菌體特異性蛋白的初步鑒定 分別對(duì)致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238、E0239、E0240進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，將其懸浮于滅菌生理鹽水制成細(xì)菌懸液(108個(gè)細(xì)菌/ml)，1.5‰甲醛滅活后離心后將菌體重懸于滅菌生理鹽水并分別取0.1ml并與等體積佐劑充分混合后，分別腹腔接種免疫不同的ICR小鼠，加強(qiáng)免疫3次，最后一次免疫不加佐劑，免疫間隔時(shí)間為1

7、2-14天，最后一次免疫后12天分離抗血清。然后與同血清型的雞源大腸桿菌菌體裂解物共溫育，去除交叉反應(yīng)性抗體，通過SDS-PAGE和Western blotting分析和鑒定致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌菌體特異性抗原。研究結(jié)果顯示，致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238(血清型為02)、E0239(血清型為021)存在一個(gè)差異性表達(dá)的蛋白，大小大約為68kDa。 5、致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌外膜蛋白的鑒定 為了研究致鵝卵黃

8、性腹膜炎性大腸桿菌與其它大腸桿菌在外膜蛋白表達(dá)上的異同，分別提取了5株致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌和2株從雞分離的大腸桿菌的外膜蛋白，通過SDS-PAGE和Western-blotting試驗(yàn)(抗鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌的血清)研究發(fā)現(xiàn)致鵝卵黃性腹膜炎性大腸桿菌E0238、E0239均有一條約68kDa的蛋白條帶。將這一特異蛋白條帶從SDS-PAGE凝膠中切取后，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，獲得的肽質(zhì)量指紋譜(PMF)數(shù)據(jù)經(jīng)MASCO