致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌cya、crp雙基因缺失突變株的構建及其相關功能性分析.pdf

1、鵝卵黃性腹膜炎(俗稱蛋子瘟)，多發(fā)于產蛋高峰期的種鵝群，該病死亡率較高并且可導致種蛋受精率和出雛率下降，它是家禽重要的細菌性傳染病，病原為禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)，且易與其它病原性細菌、病毒并發(fā)或混合感染，本病已嚴重影響到養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。由于APEC血清型眾多，目前尚無商品化疫苗使用，并且伴隨細菌耐藥性問題的日趨嚴重，該病的藥物控制越來越受到嚴格限制。如何致弱APEC

2、病原菌，獲取免疫原性能好、低或無毒性的活菌疫苗以有效抵抗APEC病原菌的感染已成為養(yǎng)鵝業(yè)迫在眉睫的問題。
　　 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)某些管家基因的缺失會引起細菌毒力的減弱，例如cya(adenylate cyclase)、crp(cAMP receptor protein)基因。這兩個基因分別是編碼合成cAMP的腺苷酸環(huán)化酶以及編碼cAMP的受體蛋白CRP。cAMP與CRP是菌體轉運和降解營養(yǎng)物質過程中的調控因子，cAMP受體蛋

3、白CRP也是目前已知的大腸桿菌7個總調控蛋白中最為重要的一個，它調控了約50％的轉錄單位的起始。鑒于cya、crp基因的重要作用，其與致病因子的關系必然成為近來研究的一個熱點。已有報道國外學者已在鼠傷寒沙門氏菌和APEC病原菌O2，O78血清型中成功構建cya、crp雙基因缺失株，并在動物體內證實缺失株毒力的致弱，且保留了良好的免疫原性。
　　 本實驗基于cya、crp基因的已知序列，利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)對致鵝卵黃性腹膜炎

4、大腸桿菌優(yōu)勢血清型國內分離株G8107(血清型O2∶K89)、G803(血清型O39∶K89)、G8102(血清型未定)，和大腸桿菌J5(脂多糖突變株)的cya、crp基因進行敲除，構建△cya△crp雙突變株。其主要構建步驟為：首先PCR擴增出兩翼與cya基因上下游序列同源，中間為氯霉素抗性基因的DNA片段，然后轉化入G8107、G803、G8102和J5，在Red重組系統(tǒng)表達重組酶的幫助下，含氯霉素抗性基因的PCR產物通過其兩側的c

5、ya基因同源序列與禽大腸桿菌染色體上的cya基因發(fā)生同源重組，通過氯霉素抗性平板篩選得到陽性克隆，對篩選得到的陽性克隆再導入編碼Flp重組酶的質粒pCP20，通過第二次重組去除抗性基因，結合PCR擴增和測序鑒定，從而證明△cya突變株G8107△cya、G803△cya、G8102△cya、J5△cya構建正確。在成功構建△cya突變株的基礎上用相同的方法繼續(xù)構建△cya△crp雙基因突變株。
　　 在成功構建單突變株△cya與

6、雙突變株△cya△crp缺失株的基礎上，比較分析了野生株和單突變株以及雙突變株在糖酵解、生長速度、毒力致弱方面的生物學特性。突變株體外酵解試驗表明，與野生株不同，其不能正常利用乳糖、麥芽糖、蔗糖；生長速度試驗表明突變株明顯低于野生株，這是由于細菌缺少在轉運和降解營養(yǎng)物質過程中發(fā)揮調節(jié)作用的cya、crp基因，從側面證實cya、crp基因的正確缺失。通過一日齡氣管環(huán)接種雛雞構建動物模型，檢測突變株毒力試驗，結果表明6日內最高劑量組(3×1

7、09CFU)中野生株、△cya突變株、△cya△crp雙突變株的死亡率分別為60％、20％、0％，實驗結果表明了雙突變株毒力較大程度的減弱。
　　 本實驗利用Red重組系統(tǒng)，成功構建了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌國內優(yōu)勢血清型分離株G8107、G8102、G803的△cya、△cya△crp突變株，并且證實了缺失株毒力的致弱?；蛉笔p毒株的成功構建，為進一步深入研究禽致病性大腸桿菌管家基因cya、crp與其致病力相互作用的關系提供