F18ab+大腸桿菌hcp基因缺失株的構(gòu)建及其對重要毒力因子分泌功能的影響.pdf

1、[研究背景]產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)F18ab菌株是引起斷奶仔豬腹瀉和水腫病的重要致病菌，長期以來給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失，掌握該致病菌的致病機制達到防控疾病發(fā)生成為科研工作者長期的目標(biāo)。該菌強大的致病力主要源自于它的毒力因子，包括Ⅰ型菌毛、F18ab菌毛、鞭毛、AIDA(adhesininvolvedindiffuseadherence)、stx2e等。而這些毒力因子有的分布在菌體的外表面，起著粘附宿主細胞的作用，有的分泌在

2、菌體外環(huán)境中，破壞宿主細胞，這些毒力因子都需要細菌本身的分泌途徑在它們合成和表達完成以后運輸?shù)骄w外，這個分泌的過程在很大程度上影響了細菌的致病力。[實驗?zāi)康腯探索F18ab大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)中hcp基因在其重要毒力因子分泌過程中的作用，為預(yù)防和控制大腸桿菌病尋找新的切入點。[實驗方法]基于hcp基因的已知序列，利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)敲除Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)hcp基因。首先合成一對引物（引物與E.coli菌株的hc

3、p基因序列5’端同源）檢測實驗菌株(E.coliF18ab)是否含有hcp基因，獲得其基因序列。再根據(jù)實驗菌株的hcp基因序列合成一對引物（引物5’端與hcp基因同源，3'端與氯霉素抗性基因cat同源）用來獲得帶氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌F18ab菌株中，在Red重組系統(tǒng)表達重組酶的幫助下，氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物通過其兩側(cè)的hcp基因同源序列與大腸桿菌染色體上的hcp基因發(fā)生同源重組，通過氯霉素抗性平板篩選得到陽

4、性克隆，對篩選得到的陽性克隆再導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，通過第二次重組去除抗性基因，結(jié)合PCR擴增和測序結(jié)果，證明hcp基因缺失株F18ab△hcp的正確構(gòu)建。然后比較分析該突變?nèi)笔е昱c野生株的生物學(xué)特性（主要包括細菌的生長狀況，生化反應(yīng)，運動能力，體外IPEC-J2細胞粘附和侵襲能力，小鼠排毒帶菌量變化以及對Vero細胞的殺傷力能等幾個方面）。[實驗結(jié)果]同F(xiàn)18ab野生株相比，△hcp突變株的運動能力下降了18.8％，對

5、豬小腸上皮細胞的體外粘附和侵襲能力分別下調(diào)了40％和28％;小鼠排毒帶菌試驗結(jié)果顯示攻毒24h后△hcp突變株的排毒量增加，表明突變株在小鼠體內(nèi)粘附能力下降;并且細胞毒性試驗結(jié)果表明，△hcp突變株實驗組的Vero細胞存活量是野生株實驗組的7倍;但是，通過RealTime-PCR試驗檢測分析△hcp突變株的Ⅰ型菌毛fimH)、F18ab菌毛(fedF)、鞭毛(fliC），AIDA(adhesininvolvedindiffuseadhe