嗜吞噬細胞無形體msp2、msp4蛋白的原核表達及免疫原性研究.pdf

1、嗜吞噬細胞無形體是經(jīng)蜱傳播的專性的革蘭氏陰性小球桿菌,還是重要的人獸共患病病原體,不僅可以感染人,也可以感染牛羊反芻動物,及馬和狗等家養(yǎng)動物。自20世紀90年代初于美國首次發(fā)現(xiàn)以來,澳洲、歐洲多國、韓國及我國先后均有報道,且近年來呈上升趨勢。由于該病的臨床多表現(xiàn)為急性不明原因發(fā)熱,肌肉痛,乏力,頭痛等類似病毒感染性疾病癥狀,臨床缺乏對該病的足夠認識,也缺乏相應的快速診斷方法,因此該病及易發(fā)生誤診,嚴重時可導致多器官功能衰竭,甚至死亡,所

2、以對該病的確診就要結(jié)合實驗室檢測進行診斷,目前應用于實驗室檢測方法主要有IFA、急性期的血液涂片檢查、巢氏PCR、直接對病原的分離培養(yǎng)。但是免疫熒光方法(IFA)不僅需要特殊儀器如熒光顯微鏡,還需要等到恢復期采集第二次血液標本。病原體分離培養(yǎng)診斷十分可靠,但分離率低且耗時。以PCR為基礎的分子生物學技術可以取代分離培養(yǎng)進行病原體檢測,但需要特殊的儀器及具備一定實驗室經(jīng)驗的人員才能完成。因此開發(fā)一種簡便的靈敏性的高特異性的檢測方法對于該病

3、原體的診斷是很有必要的。
　　嗜吞噬細胞無形體的OMP1/MSP2/P44蛋白超家族是無形體的特征性的蛋白家族,該家族基因包含3個OMP1、1個msp2、2個msp2同源基因、1個msp4、113個p44 loci基因,可以作為診斷該病原的選擇依據(jù)。本實驗選取了 msp2及msp4兩個主要表面蛋白作為研究的對象,對E-msp2、N-msp4、Z-msp4三個主要表面蛋白的全長基因進行原核表達,分別構(gòu)建了pET32a、pET28a、

4、pGEX-4T-1三個原核表達載體,誘導表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個全長序列均未能在原核系統(tǒng)中進行表達,通過查閱文獻顯示可能與信號肽的存在有關聯(lián);進而對三個全長序列進行信號肽的分析,結(jié)果顯示在三個全長的序列的N端都存在信號肽序列,信號肽序列影響其原核表達。
　　通過對三個全長序列的生物信息學的分析,在去除信號肽的前提基礎上,選取了富含抗原表位區(qū)的序列,進行PCR擴增和原核表達載體的構(gòu)建,并在原核細胞中成功表達目的蛋白,證明信號肽序列影響了全長

5、序列在原核中的表達。在pET32a原核表達載體誘導表達后,三個蛋白的主要表達的形式是包涵體形式,通過親和層析方法對表達的蛋白進行純化,經(jīng)WB驗證三個重組蛋白的免疫原性。
　　利用原核表達的重組蛋白建立了ELISA檢測方法,抗原在4℃過夜條件下包被,包被濃度為100μg/mL,待檢血清稀釋倍數(shù)為1:200,5％的脫脂奶粉37℃封閉1h,酶標二抗的最佳工作濃度為1:5000,底物顯色10min,利用重組蛋白與羊布魯氏菌、羊萊姆病陽性血