人IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段的基因合成原核表達(dá)及免疫原性分析.pdf

1、免疫球蛋白M(IgM)是人的免疫球蛋白之一,根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同將免疫球蛋白分為五種,其他還有l(wèi)gA、lgG、IgD和lgE。IgM占血清免疫球蛋白總量的5％-10%,是分子量最大的Ig,一般不能通過(guò)血管壁,主要存在于血液中。IgM也是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體,是機(jī)體抗感染的“先頭部隊(duì)”,血清中檢出IgM提示新近發(fā)生感染,可用于感染的早期診斷。在感染過(guò)程中IgM首先出現(xiàn),但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng),是近期感染的標(biāo)志。
　　IgM分子包括重鏈

2、μ鏈和輕鏈λ,輕鏈?zhǔn)歉黝?lèi)免疫球蛋白共有,重鏈μ鏈?zhǔn)荌gM分子所特有的,已有研究表明抗人IgMμ鏈單克隆抗體可用于多種感染性疾病的早期診斷以及免疫學(xué)的研究。但是用于制備抗人IgMμ鏈單克隆抗體的天然的IgMμ鏈來(lái)源少,制備方法繁瑣,價(jià)格較高,而且IgMμ鏈本身易降解。因此,本研究利用基因工程技術(shù),通過(guò)重組構(gòu)建、原核表達(dá)IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段,并對(duì)其免疫原性進(jìn)行檢測(cè),以期得到免疫原性同天然IgMμ鏈相近的肽段,能夠進(jìn)一步用于制備抗人IgMμ

3、鏈單克隆抗體。
　　本研究分為一下兩個(gè)部分:
　　第一部分，基因合成以及原核表達(dá)IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段
　　分析IgM的結(jié)構(gòu),IgM的重鏈有一個(gè)可變區(qū)(VH)和四個(gè)恒定區(qū)(CHl、CH2、CH3和CH4)共五個(gè)功能區(qū)。VL和VH是與抗原結(jié)合的部位,單體由一對(duì)L鏈和一對(duì)H鏈組成的基本結(jié)構(gòu),有2個(gè)與抗原結(jié)合的位點(diǎn),共分為可變區(qū)和恒定區(qū),H和L鏈上都有可變區(qū),同類(lèi)重鏈和同型輕鏈的近N端約110個(gè)氨基酸序列的變化很大,其他部分

4、的氨基酸序列相對(duì)恒定,據(jù)此可將輕鏈和重鏈區(qū)分為可變區(qū)(V)和恒定區(qū)(C)。IgM分子包括重鏈μ鏈和輕鏈λ,輕鏈?zhǔn)歉黝?lèi)免疫球蛋白共有,重鏈μ鏈?zhǔn)荌gM分子所特有。
　　通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)的到人IgMμ鏈恒定區(qū)完整的氨基酸序列,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)IgMμ鏈恒定區(qū)(CH1-CH4)的cDNA序列并進(jìn)行必要的大腸桿菌密碼子優(yōu)化,本研究構(gòu)建了并原核表達(dá)了IgMμ鏈恒定區(qū)3個(gè)肽段。具體方法如下:分別獲得IgMμ鏈(CH1-CH

5、4)、IgMμ鏈(CH1-CH2)、IgMμ鏈(CH3-CH4)基因片段,利用重疊延伸PCR(OverlapExtensionPloymeraseChainReaction,OE-PCR)體外基因合成人IgMμ鏈恒定區(qū)全長(zhǎng)(CH1-CH4)及其截?cái)嗥蜟H1-CH2和CH3-CH4。用T/A克隆法將各片段克隆至pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的序列分別克隆到原核表達(dá)載體pPET-32a,構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒:PET32a-rMμCH

6、1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4,將上述原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得3種截短的IgMμ鏈恒定區(qū)融合蛋白ET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4,其相對(duì)分子量分別約為:69.8KD、43.8KD、46.9KD并用Ni-NTA親和層析法純化目的融合蛋白。通過(guò)12%SDS-PAGE

7、電泳分析,分別可見(jiàn)分子量約為69.8KD、43.8KD、46.9KD左右的特異的條帶,大小與理論值相符。表明本研究成功構(gòu)建并表達(dá)出PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白。
　　第二部分，重組蛋白免疫原性分析及與天然人IgM、IgMμ鏈和IgG比較
　　用PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3

8、-CH4融合蛋白分別免疫BALB/c小鼠,制備小鼠抗血清,用以觀(guān)察誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)IgMμ鏈的特異性抗體情況;用天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG免疫BALB/c小鼠,制備小鼠抗血清,以檢測(cè)融合蛋白PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4誘導(dǎo)產(chǎn)生產(chǎn)生針對(duì)IgMμ鏈的特異性抗體于天然IgM、IgMμ鏈之間的差異,以及天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG之間交叉反應(yīng)性。
　　

9、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,上述PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白均可以與天然的IgM、IgMμ鏈特異性反應(yīng),表明重組蛋白具有與天然IgMμ鏈的反應(yīng)能力,保留了IgMμ鏈的免疫原性。然而,重組蛋白的免疫原性較天然的IgMμ鏈稍弱,誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度稍偏低,(取對(duì)數(shù)后抗體滴度為3.2-2),而天然的IgMμ鏈誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗體滴度(取對(duì)數(shù)后抗體滴度為4.5),提示

10、截?cái)啾磉_(dá)IgMμ鏈可能對(duì)其免疫原性產(chǎn)生影響。其次天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG免疫產(chǎn)生的抗血清,IgM免疫的血清與IgG有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性,同樣IgG免疫的血清與IgM也存在較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性;與IgM不一樣的IgMμ免疫的血清與IgG交叉反應(yīng)弱。
　　總結(jié):
　　1.本研究成功構(gòu)建3種IgMμ鏈重組肽段的原核表達(dá)質(zhì)粒并經(jīng)E.coli表達(dá),獲得了3種截短的IgMμ鏈3個(gè)肽段的重組蛋白。
　　2.所構(gòu)建的3種蛋白PET

11、32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4均較好的保留了IgMμ鏈的免疫原性,誘導(dǎo)出較高滴度的針對(duì)IgMμ鏈的特異性抗體,提示重組的3各肽可能可以代替天然的IgMμ鏈,成為制備抗IgMμ鏈單克隆抗體的原料。為利用基因工程探尋天然IgMμ鏈的代替品奠定了基礎(chǔ)。
　　3.用天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG免疫BALB/c小鼠,制備小鼠抗血清,IgM免疫的血清與IgG有較強(qiáng)的交

12、叉反應(yīng)性,IgG免疫的血清與IgM也存在較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性;與IgM不一樣的IgMμ鏈免疫的血清與IgG交叉反應(yīng)弱。而重組的PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白與IgG無(wú)明顯的交叉反應(yīng),提示抗IgMμ鏈的單克隆抗體比抗IgM的單克隆抗體更具特異性,在臨床感染性疾病的早期診斷和免疫學(xué)的研究就中更加的精確,重組的PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rM