通心絡(luò)改善慢性缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害及其作用機制.pdf

1、目的:血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接是決定內(nèi)皮細(xì)胞間滲出的最主要結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)由排列在胞膜和胞漿的跨膜蛋白家族(occludin和claudin)、膜周蛋白家族（ZO蛋白）等構(gòu)成，起著選擇性通透和維持細(xì)胞極性、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。慢性缺氧是一種常見的導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的病理因素，可通過損傷破壞內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能引發(fā)多種心血管疾病。所以積極改善缺氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能受損對防治心血管疾病有重要意義。
　　通心絡(luò)(Tongxinluo，TXL)為純中

2、藥制劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療心腦血管病，能有效改善穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)作。最近研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)能夠明顯抑制缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3活性的增高并減少缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;通心絡(luò)可通過PI-3K/Akt/HIF信號通路上調(diào)內(nèi)皮HIF表達提高血管內(nèi)皮細(xì)胞對缺氧的耐受性。本研究一方面從整體水平觀察慢性缺氧對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及通心絡(luò)的改善作用;另一方面在細(xì)胞水平上探討通心絡(luò)改善缺氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損害的作用機制，為心血管疾病的防治提

3、供一個新的靶點。
　　方法:C57BL/6J小鼠隨機分為對照組，缺氧組和通心絡(luò)預(yù)孵育組，缺氧組和通心絡(luò)預(yù)孵育組置于自制低壓氧艙內(nèi)，每天6小時，共28天。對照組每天灌生理鹽水，通心絡(luò)預(yù)孵育組按7.5mg/10g體重每天給予通心絡(luò)超微粉混懸液灌胃。28天后檢測兩組小鼠耳、牙齦、皮膚微循環(huán)狀況;取小鼠肺、肝、胸主動脈進行免疫組化染色。培養(yǎng)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分組給予通心絡(luò)和氯化鈷刺激，western bolt和Real-time方法分

4、別檢測緊密連接蛋白和KLF4的表達;過表達KLF4及過表達KLF4同時孵育通心絡(luò)，Western bolt和Real-time PCR檢測緊密連接蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.慢性缺氧誘導(dǎo)小鼠肝組織的HIF-1α表達慢性缺氧組肝組織內(nèi)HIF-1α的陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于正常對照組;三組相比，通心絡(luò)預(yù)孵育組小鼠肝組織內(nèi)HIF-1α陽性細(xì)胞最為明顯，提示通心絡(luò)能提高小鼠對慢性缺氧的適應(yīng)能力。
　　2.通心絡(luò)誘導(dǎo)缺氧肺、肝組

5、織新生血管的形成CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志因子，為了進一步觀察通心絡(luò)對缺氧小鼠新生血管生成的影響，我們通過免疫組化檢測CD31陽性細(xì)胞的數(shù)量以評價通心絡(luò)對新生血管生成的作用。結(jié)果顯示，通心絡(luò)預(yù)孵育組肺、肝組織內(nèi)的CD31陽性細(xì)胞數(shù)及深染程度明顯高于缺氧組，提示通心絡(luò)可以誘導(dǎo)慢性缺氧小鼠的肺、肝組織內(nèi)新生血管形成。
　　3.通心絡(luò)不改變?nèi)毖跣∈蠖?、牙齦和皮膚的微循環(huán)狀況采用血液微循環(huán)檢測儀檢測小鼠耳、牙齦和皮膚的微循環(huán)狀況。結(jié)果顯

6、示，缺氧組和通心絡(luò)預(yù)孵育組小鼠的耳朵、牙齦和皮膚的微血管循環(huán)狀況無明顯差異。
　　4.通心絡(luò)促進缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖為進一步探討通心絡(luò)促進慢性缺氧小鼠血管新生的分子機制，我們以體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，以氯化鈷作為缺氧誘導(dǎo)因素，CCK-8法觀察通心絡(luò)對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，通心絡(luò)預(yù)孵育可以顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，說明通心絡(luò)可以濃度依賴性的促進缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
　　5.通心絡(luò)促進內(nèi)皮細(xì)胞成血管內(nèi)皮細(xì)

7、胞血管生成實驗結(jié)果顯示，通心絡(luò)預(yù)孵育組細(xì)胞與缺氧組相比，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間的連接加強。提示，通心絡(luò)可以促使缺氧狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞成血管。
　　6.通心絡(luò)促進缺氧小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白和KLF4的表達血管緊密連接蛋白是決定血管內(nèi)皮細(xì)胞間滲出的最主要結(jié)構(gòu)蛋白，進一步研究發(fā)現(xiàn)，與缺氧組相比，通心絡(luò)預(yù)孵育可以顯著提高血管內(nèi)皮緊密連接蛋白occludin，claudin1和KLF4的表達，對ve-cadherin和

8、beta-catenin的表達影響不明顯。提示通心絡(luò)誘導(dǎo)缺氧主動脈內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達可能與KLF4有關(guān)。
　　7.KLF4可能介導(dǎo)通心絡(luò)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白occludin和claudin1的表達Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，通心絡(luò)預(yù)孵育可以顯著誘導(dǎo)HIF-1a、ve-cadherin、claudin1和KLF4的表達。過表達KLF4，ve-cadherin和beta-catenin的

9、表達沒有變化，occludin和claudin1的表達下降。通心絡(luò)預(yù)孵育后過表達KLF4， occludin和claudin1的表達明顯高于KLF4過表達組。上述結(jié)果提示，過表達KLF4抑制occludin和claudin1的表達（或影響不大），通心絡(luò)預(yù)孵育逆轉(zhuǎn)了KLF4的作用，顯著促進occludin和claudin1的表達，提示通心絡(luò)可能通過某種作用機制改變了KLF4的修飾狀態(tài)。
　　8.通心絡(luò)誘導(dǎo)緊密連接蛋白occludin

10、和claudin1表達與促進KLF4磷酸化有關(guān)。
　　為了進一步明確通心絡(luò)與KLF4之間的關(guān)系，我們用免疫共沉淀檢測了KLF4的磷酸化修飾狀態(tài)，結(jié)果顯示，通心絡(luò)可以促進KLF4磷酸化，提示，通心絡(luò)誘導(dǎo)緊密連接蛋白occludin和claudin1表達與促進KLF4磷酸化有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.通心絡(luò)能提高慢性缺氧小鼠肝組織對缺氧的適應(yīng)能力。
　　2.通心絡(luò)誘導(dǎo)慢性缺氧小鼠肺、肝組織中新生血管生成。