我國(guó)HIV-1流行毒株的分離鑒定及Rev蛋白第101位提前終止的生物效應(yīng)研究.pdf

1、引發(fā)艾滋病的人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）具有高度的變異性。全球廣泛傳播的HIV-1分為M群、O群、N群和P群，HIV-1的M群包括9個(gè)亞型、72個(gè)流行重組毒株（CRFs）和無(wú)數(shù)獨(dú)特重組毒株（URFs）。HIV-1不僅基因型高度多樣，還有復(fù)雜的表型特征。主要包括復(fù)制能力和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、致細(xì)胞病變的作用、細(xì)胞嗜性、輔助受體使用和Env蛋白的V3環(huán)頂端氨基酸序列等。這些生物學(xué)表型特征之間有緊密的聯(lián)系，并與HIV-1的致病性、傳播能力、免疫逃逸及疾

2、病進(jìn)程密切相關(guān)。
　　由于可代表體內(nèi)病毒真實(shí)情況的HIV-1臨床分離毒株難以獲得，相對(duì)于基因序列水平的研究，表型研究的難度很大。正因如此，基因型研究獲得的大量提示性結(jié)果也未能在表型層面得到驗(yàn)證。我國(guó)流行的HIV毒株復(fù)雜多樣，主要流行毒株有B（包括Thai-B）、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC這4個(gè)基因型的毒株，還有大量新型重組毒株。目前，由于對(duì)我國(guó)HIV-1流行毒株生物學(xué)表型的研究缺乏，導(dǎo)致我們不能全面理解我

3、國(guó)HIV-1流行毒株的生物學(xué)特征、不能科學(xué)解釋近幾年臨床上發(fā)現(xiàn)的病程速率改變的現(xiàn)象，也極大地影響了疫苗等生物防治方法的研究。CRF07_BC是在我國(guó)云南形成的以C亞型毒株為骨架插入B亞型片段的流行重組毒株，最初主要在吸毒人群中流行，近幾年也擴(kuò)散進(jìn)入性傳播人群特別是男男同性傳播人群，占全國(guó)感染總數(shù)的35.5％。大量研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)毒株具有獨(dú)特的致病特征，例如，感染這個(gè)毒株的人初始 CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)較高病程進(jìn)展可能較慢。然而此毒株的感染性和致

4、病性相關(guān)因素目前尚缺乏研究。
　　本研究首先進(jìn)行了我國(guó) HIV-1流行毒株分離培養(yǎng)和全面的生物學(xué)表型特征研究，構(gòu)建了具有充分多樣性的毒株樣本盤(pán)，并對(duì)我國(guó)常用的病毒載量和p24抗原檢測(cè)試劑進(jìn)行了評(píng)價(jià)?；谖覀儼l(fā)現(xiàn)的以CRF07_BC為代表的HIV-1C類(lèi)病毒特有的Rev101提前終止現(xiàn)象，進(jìn)行了Rev-RRE對(duì)復(fù)制和感染影響的研究。以期全面了解我國(guó)HIV-1流行毒株的表型特征，為揭示致病機(jī)制及生物防治研究奠定基礎(chǔ)。
　　第一章

5、我國(guó)HIV-1流行毒株的分離鑒定和表型特征研究
　　我國(guó)流行 HIV-1毒株的基因型和表型的多樣性對(duì)病毒傳播和病程進(jìn)展有顯著影響。目前我國(guó)HIV-1多樣性研究大多停留在序列和基因型層面，缺乏生物學(xué)表型研究，病毒表型多樣性與毒力及致病性之間的關(guān)系亟待闡明。另外，HIV-1毒株的多樣性和復(fù)雜性為艾滋病監(jiān)測(cè)和診斷方法的完善，疫苗的研發(fā)和臨床治療帶來(lái)了一系列挑戰(zhàn)。目前缺少能代表我國(guó)HIV-1多樣性的毒株樣本盤(pán)用于對(duì)相關(guān)檢測(cè)和生物防治方法的

6、適用性評(píng)價(jià)。
　　目的：分離培養(yǎng)我國(guó)流行的HIV-1毒株，對(duì)其復(fù)制能力和表型特征進(jìn)行全面鑒定；建立一組能代表我國(guó)流行HIV-1毒株多樣性并可以用于艾滋病檢測(cè)方法評(píng)估的HIV-1樣本盤(pán)。
　　方法和結(jié)果：（1）樣本的采集與病毒的分離培養(yǎng)：1）通過(guò)我國(guó)HIV-1耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目從10個(gè)省市收集48例HIV感染者的新鮮抗凝外周靜脈血液樣本，分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），與健康供血者的PBMCs共培養(yǎng)，在生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)2

7、8天，期間定時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得我國(guó)2010年至2013年間HIV-1臨床分離株14株。2）對(duì)我實(shí)驗(yàn)室2002年至2009年間初步分離的51株病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定傳代的病毒分離株16株。最終共獲得30株高濃度（106-109 cp/ml）、大量（>40ml）液氮凍存保種的病毒株。分離的病毒包括B（13例），CRF01_AE（12例）和CRF07_BC（4例）三種我國(guó)廣泛流行的毒株和較為罕見(jiàn)的G亞型（1例）毒株；傳播途徑包括血

8、液傳播（13例）、同性性傳播（8例）、異性性傳播（6例）、靜脈吸毒傳播（1例）及傳播途徑不明（2例）。（2）序列測(cè)定及基因型鑒定：對(duì)病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，得到6條HIV-1全長(zhǎng)基因組序列、77條gag/pol區(qū)全長(zhǎng)或envC2V3區(qū)序列（分別為25，27和25條），經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析，證實(shí)30例樣本包括如上所述4個(gè)亞型，且CRF01_AE毒株分屬于3個(gè)傳播簇。（3）復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究：p24抗原濃度大于2ng/ml的11株毒株中3株為相對(duì)快

9、/高型（R/H）復(fù)制毒株，且均有致合胞體形成的能力（SI），其中一株CRF01_AE亞型的毒株復(fù)制能力極強(qiáng)，是參考毒株NL4-3的217倍。（4）通過(guò)envV3區(qū)序列預(yù)測(cè)env相關(guān)的表型：1）輔助受體使用：17株為使用CCR5輔助受體的M嗜性毒株，12株為使用CXCR4/CCR5的雙嗜性毒株，有1例無(wú)法預(yù)測(cè)?？?高型復(fù)制且可致合胞體形成（Syncytia inducing, SI）的4個(gè)毒株都是X4/R5雙嗜性，復(fù)制快/高但不致合胞體形

10、成（Non-syncytia inducing, NSI）的SX2010001只使用CCR5輔助受體；2）V3環(huán)頂端四肽包括GPGR，GPGQ， GQGR，GPGH和 GWGR共5種，復(fù)制相對(duì)較高的5個(gè)毒株的頂端四肽均為GPGR；3）糖基化位點(diǎn)：所有毒株的V3環(huán)糖基化位點(diǎn)為8～13個(gè)，其中17、30、36、42、98、131和137位為大部分毒株共有的糖基化位點(diǎn)，復(fù)制能力相對(duì)較高的5個(gè)毒株中有4個(gè)在第3位出現(xiàn)了N-糖基化，而其他毒株中均

11、未出現(xiàn)此糖基化位點(diǎn)，提示可能與病毒的感染和復(fù)制能力相關(guān)。（5）根據(jù)pol區(qū)序列鑒定耐藥突變位點(diǎn)：在得到pol區(qū)序列的27個(gè)毒株中有16個(gè)出現(xiàn)耐藥突變位點(diǎn)，其中7個(gè)可能會(huì)出現(xiàn)中高度耐藥，而其中2個(gè)未經(jīng)治療。（6）以30株HIV-1流行毒株作為樣本盤(pán)對(duì)2種常用檢測(cè)試劑進(jìn)行評(píng)估：以30株病毒的培養(yǎng)上清液對(duì)NucliSens EasyQ HIV-1 version2.0和Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 te

12、st version2.0這2種病毒載量試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)2種試劑盒對(duì)B亞型毒株的檢測(cè)具有良好的一致性，而對(duì) CRF01_AE毒株檢測(cè)的一致性相對(duì)較差，提示現(xiàn)有的試劑檢測(cè) CRF01_AE毒株的病毒載量還有待改進(jìn)。另外還評(píng)價(jià)了2種 HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑。
　　結(jié)論：獲得了高濃度并大量?jī)龃姹７N且人口學(xué)和生物學(xué)背景清晰的30株我國(guó)HIV-1流行毒株，具有充分的基因型和表型多樣性。發(fā)現(xiàn)一株復(fù)制能力極強(qiáng)的CRF01_AE亞型毒株

13、，發(fā)現(xiàn)常用的病毒載量試劑檢測(cè)我國(guó)廣泛流行的CRF01_AE毒株的一致性較差，提示需要針對(duì) CRF01_AE毒株改善性能。這項(xiàng)研究為揭示我國(guó)HIV-1的致病機(jī)制及生物防治研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二章 HIV-1 C類(lèi)病毒Rev蛋白第101位密碼子提前終止現(xiàn)象及其生物效應(yīng)研究
　　HIV-1的Rev是病毒復(fù)制過(guò)程中的調(diào)節(jié)蛋白，通常由116個(gè)氨基酸組成，主要作用是特異性結(jié)合未剪輯及未剪輯完成的mRNA上的Rev蛋白反應(yīng)元件（Rev

14、 Response Element, RRE），幫助病毒mRNA完成出核轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)行后續(xù)表達(dá)。RRE是病毒mRNA經(jīng)過(guò)多樣化剪輯后，未剪輯或未剪輯完成的mRNA的內(nèi)含子上的一段RNA，是Rev蛋白結(jié)合mRNA的靶標(biāo)。通過(guò)Rev與RRE的相互作用，使得mRNA得以轉(zhuǎn)運(yùn)出核膜完成表達(dá)。以往的研究主要針對(duì)歐美常見(jiàn)B亞型毒株Rev蛋白的第35~50位和第73~84位氨基酸的兩個(gè)主要功能域，未見(jiàn)對(duì)非B亞型Rev蛋白及其C末端結(jié)構(gòu)和功能的研究。在對(duì)我

15、國(guó)部分地區(qū)HIV-1 rev基因進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)C亞型和以C為骨架的重組病毒，Rev蛋白的第108位氨基酸（HXB2：101位）出現(xiàn)了一個(gè)提前終止密碼子（Premature termination codon, PTC），這在其它亞型毒株中極少見(jiàn)到。
　　目的：鑒定Rev蛋白101位提前終止現(xiàn)象（Rev101PTC）是否為HIV-1 C類(lèi)病毒所特有。分析其對(duì) Rev-RRE功能活性、病毒復(fù)制能力以及病毒進(jìn)化和傳播

16、的可能影響。
　　方法與結(jié)果：（1）比較Rev101PTC在HIV各類(lèi)毒株中出現(xiàn)的頻率以確定其是否為 C類(lèi)病毒的特征：從 Los Alamos HIV Database下載了 HIV-1各亞型共3041條可用的rev基因序列，逐條比對(duì)校正并翻譯，發(fā)現(xiàn)Rev101PTC在HIV-1 C類(lèi)病毒（C亞型和以C為骨架的重組病毒）中出現(xiàn)頻率為93.8%，而在其它亞型中出現(xiàn)的頻率為0.9%（P＜0.001），證明Rev101提前終止現(xiàn)象為 C

17、類(lèi)病毒所特有。（2）驗(yàn)證 Rev101PTC對(duì)病毒復(fù)制能力的影響：1)將 B亞型感染性克隆pNL4-3上Rev第101位密碼子CAA（非終止）突變?yōu)門(mén)AA（終止），轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞并包裝出病毒，發(fā)現(xiàn)Rev101PTC的引入導(dǎo)致B亞型NL4-3毒株的復(fù)制能力的大幅下降（約2~4個(gè)log值）。2)以CRF07_BC為C類(lèi)病毒的代表，將其感染性克隆pXJDC6291-13上Rev第101位密碼子TAA（終止）突變?yōu)镃AA（非終止），將突

18、變前后質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)突變前后病毒的p24抗原（gag-pol編碼）表達(dá)水平無(wú)差異。3)對(duì)編碼Rev蛋白的mRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析Rev101PTC對(duì)B和CRF07_BC兩個(gè)毒株Rev mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)Rev101PTC的引入造成B亞型Rev mRNA的“莖環(huán)”易位，顯著改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)；而Rev101PTC存在與否對(duì)CRF07_BC Rev mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)并無(wú)影響，只是“莖狀”結(jié)構(gòu)上一個(gè)GU配對(duì)變?yōu)?/p>

19、GC配對(duì)。4)為了驗(yàn)證Rev101PTC的引入是否會(huì)影響Rev蛋白的表達(dá)水平，將2種亞型Rev101密碼子突變前后的表達(dá)質(zhì)粒等量轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞，通過(guò) Western Blot檢測(cè) Rev蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn) RevB>RevBmut(101PTC)，而Rev07BC(101PTC)≈Rev07BCmut，說(shuō)明Rev101PTC對(duì)B亞型Rev蛋白的表達(dá)有影響，而對(duì)CRF07_BC的Rev蛋白的影響不明顯。（3）構(gòu)建GagPol-RRE報(bào)

20、告基因表達(dá)體系并驗(yàn)證Rev101PTC和不同基因型的RRE對(duì)Rev-RRE復(fù)合體功能的影響：構(gòu)建B和CRF07_BC毒株有和沒(méi)有101PTC的4個(gè) Rev表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1(+)-Rev-B、pcDNA3.1(+)-Rev-Bmut(101PTC)、pcDNA3.1(+)-Rev-07BC(101PTC)和 pcDNA3.1(+)-07BCmut）；構(gòu)建 B和CRF07_BC毒株的RRE連接gag-pol基因的2個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒（

21、pcDNA3.1(+)-GagPol-RRE_B和pcDNA3.1(+)-GagPol-RRE_07BC）。將2個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒分別與4個(gè)Rev表達(dá)質(zhì)粒配對(duì)，組成8個(gè)反應(yīng)體系。用不同濃度梯度的Rev表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，外源 Rev蛋白就結(jié)合報(bào)告基因質(zhì)粒上的RRE，幫助與之相連的gag-pol基因完成出核表達(dá)，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中 gag-pol的表達(dá)產(chǎn)物（p24抗原），繪制p24含量隨Rev表達(dá)質(zhì)粒濃度變化的曲線，以曲線上升段線性擬

22、合的斜率為指標(biāo)衡量Rev-RRE的相對(duì)活性。對(duì)得到的8組數(shù)據(jù)分別從Rev和RRE的角度進(jìn)行比較分析：1）Rev101PTC對(duì)Rev-RRE活性的影響：只有在Rev和 RRE均為 B亞型時(shí)，Rev101PTC才使 Rev-RRE的功能活性顯著下降（ P=0.0017），其他組合 Rev-RRE的功能活性均無(wú)顯著變化；而不論是否有Rev101PTC，使用 B亞型 RRE組合的Rev-RRE功能活性均顯著高于使用CRF07_BC亞型RRE的組

23、合，提示RRE的亞型特征對(duì)于Rev-RRE功能活性的影響比Rev更大。2）RRE亞型特征對(duì)于Rev-RRE活性的影響：只在與CRF07_BC的野生型Rev（含Rev101PTC）結(jié)合時(shí)，2種RRE對(duì)Rev-RRE活性的影響才無(wú)顯著性差異（P=0.074）。而與不含Rev101PTC的Rev07BCmut結(jié)合時(shí)，2種亞型RRE所造成的差異變得具有顯著性（P=0.017）。與突變前后的RevB結(jié)合時(shí)，2種亞型RRE所造成的差異更大（P值分別

24、為0.001和0.006）。（4）探究RRE上亞型特異性位點(diǎn)對(duì) Rev-RRE活性的影響：在2種亞型的RRE上選擇處于Rev結(jié)合位點(diǎn)或影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)的4組關(guān)鍵位點(diǎn)及突變，分別引入2種亞型的GagPol-RRE報(bào)告基因，構(gòu)建8個(gè)質(zhì)粒，將突變前后的RRE分別與相應(yīng)的Rev結(jié)合，檢測(cè)其對(duì)Rev-RRE功能活性的影響。結(jié)果顯示，對(duì)于RRE B， T192A和G262A-G264A突變導(dǎo)致Rev B-RRE B的功能活性顯著降低（T192A：P=

25、0.0005；G262A-G264A：P＜0.0001）。對(duì)于RRE07BC，A111G-G120A和A262G-A264G導(dǎo)致Rev07-RRE07活性降低顯著影響（P值分別為0.0171和0.0019），而A192T則使其活性升高（P=0.0024）。提示192位堿基的改變對(duì)RRE功能的影響與兩個(gè)亞型RRE本來(lái)的活性趨勢(shì)一致；262-264位點(diǎn)的堿基在兩個(gè)亞型間的正反向突變均會(huì)造成Rev-RRE活性的顯著下降。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)

26、并證實(shí)Rev101提前終止密碼是HIV-1 C類(lèi)病毒特有的現(xiàn)象。它在B亞型Rev編碼基因中的引入會(huì)顯著降低B亞型病毒的復(fù)制能力，這可能是通過(guò)打亂原有mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響Rev蛋白自身表達(dá)量來(lái)減少其它病毒蛋白的表達(dá)而造成的。但它的存在與否對(duì)HIV-1C類(lèi)病毒的復(fù)制并無(wú)影響，這可能與其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并不會(huì)因Rev101PTC而受到影響有關(guān)。C類(lèi)病毒Rev蛋白可以兼容B亞型和C亞型的RRE，這可能是C類(lèi)病毒Rev蛋白編碼基因在所有已發(fā)現(xiàn)的B