廣西HIV-1耐藥性及關(guān)聯(lián)因素研究與主要流行株亞型快速鑒定方法的建立.pdf

1、目的：調(diào)查廣西HIV-1耐藥性流行情況，并探討可能與耐藥性突變有關(guān)聯(lián)的因素；通過(guò)計(jì)算CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC發(fā)生PIs、NRTIs和NNRTIs主要耐藥性突變的基因屏障，從理論上比較不同亞型發(fā)生特定耐藥性突變的可能性大小，分析不同亞型的耐藥模式是否有差異。 方法：在廣西柳州、南寧兩市對(duì)304名HIV感染者/AIDS患者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，收集可能與HIV-1耐藥性有關(guān)聯(lián)的資料，并采集研究對(duì)象外周靜脈血，提取

2、病毒RNA，用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nested RT-PCR)擴(kuò)增編碼病毒蛋白酶1～99位氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶1～285位氨基酸的核酸序列，通過(guò)測(cè)序獲得DNA序列。將序列提交到斯坦福大學(xué)HIV耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得耐藥性突變位點(diǎn)及耐藥水平有關(guān)信息。應(yīng)用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析樣本序列的亞型。將已接受抗病毒治療的患者按不同特征分組，用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法比較不同對(duì)比組的耐藥率，分析研究對(duì)象特征與耐藥性的關(guān)聯(lián)性；通過(guò)查詢斯

3、坦福大學(xué)的HIV drug resistance database數(shù)據(jù)庫(kù)，確定PIs主要耐藥性突變21個(gè)、NRTIs主要耐藥性突變16個(gè)和NNRTIs主要耐藥性突變18個(gè)，對(duì)照密碼子表確定耐藥性密碼子及其對(duì)應(yīng)的野生型密碼子種類。 結(jié)果：獲得219份DNA序列，其中86份來(lái)自接受抗病毒治療的患者，133份來(lái)自未治療者。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，鑒定出218份樣本的亞型，包括CRF01_AE176份，CRF07_BC26份，CRF08_BC

4、13份，B亞型2份，C亞型1份。蛋白酶抑制劑(PIs)、核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)和核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)相關(guān)突變的發(fā)生率分別為6.9％(14/219)、30.14％(66/219)和14.16％(31/219)。CRF07_BC發(fā)生PIs相關(guān)突變的頻率高于CRF01_AE，CRF08_BC發(fā)生NRTIs相關(guān)突變的頻率高于CRF01_AE和CRF07_BC。PIs次要突變A71V/T主要出現(xiàn)于CRF07_BC，NR

5、TIs次要突變T69S主要出現(xiàn)于CRF08_BC。在219例患者中，至少對(duì)1種藥物低度以上耐藥者18例，總耐藥率8.22％(18/219)，其中治療患者耐藥率為17.44％(15/86)，未治療者耐藥率為2.26％(3/133)。在已經(jīng)產(chǎn)生耐藥的患者中，對(duì)NRTIs和NNRTIs的高度耐藥分別占77.78％和72.22％，交叉耐藥的比例均高達(dá)100％，二重耐藥的比例也達(dá)77.78％。耐藥與治療時(shí)間，服藥依從性和職業(yè)有關(guān)，與性別、年齡、文

6、化程度、民族、病毒亞型、傳播途徑、治療方案等因素?zé)o關(guān)。治療1～2年與治療時(shí)間≥2年耐藥率的差異無(wú)顯著性意義，而治療時(shí)間1年以上者，耐藥率高于治療<1年者(OR=8.089，P<0.030)。服藥依從性為50～90％的患者，耐藥率高于服藥依從性≥90％者(OR=8.591，P=0.030)；農(nóng)民患者的耐藥率高于其它職業(yè)和無(wú)業(yè)人員(OR=4.223，P=0.017)；農(nóng)民患者服藥依從性低于其它職業(yè)和無(wú)業(yè)人員(P=0.007)；蛋白酶編碼區(qū)的

7、大多數(shù)野生型密碼子呈高度保守，只有L10和N88的野生型密碼子在3種亞型間有較大差異，但是由于發(fā)生L10V/I和N88D/S突變時(shí)所需的堿基替換種類和數(shù)量均相同，因而3種亞型的基因屏障沒(méi)有差異(P=1.000)。 結(jié)論：廣西HIV-1耐藥率處于較低的水平，但是對(duì)NRTIs和NNRTIs耐藥的患者多為高中度耐藥、交叉耐藥和二重耐藥。抗病毒治療時(shí)間、服藥依從性和職業(yè)因素與耐藥有關(guān)，抗病毒治療1年以上、服藥依從性低于90％、職業(yè)為農(nóng)民

8、，耐藥率相對(duì)較高。農(nóng)民耐藥率較高可能與服藥依從性較低有關(guān)，提供方便的取藥渠道，加強(qiáng)教育以提高農(nóng)民患者服藥依從性可能有助于降低農(nóng)民的耐藥率。感染不同亞型的患者耐藥率沒(méi)有差異，但是不同亞型耐藥模式有所不同，A71V/T主要出現(xiàn)于CRF07_BC，而T69S主要出現(xiàn)于CRF08_BC；本研究建立的多重巢式PCR法可準(zhǔn)確鑒定CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亞型毒株。該法具有較高的靈敏度、特異度和重復(fù)性，操作簡(jiǎn)便快速、費(fèi)用