靶向沉默PNAS-2對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制探究.pdf

1、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士畢業(yè)論文2緒論緒論急性白血病(acuteleukemiaAL)是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病時(shí)骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞大量增殖并廣泛侵潤(rùn)肝，脾，淋巴結(jié)等各種臟器，致使正常造血受抑，其臨床表現(xiàn)主要是以貧血、發(fā)熱、出血、肝脾及淋巴結(jié)腫大為主。AL多起病急驟，病情發(fā)展迅速，若不予以及時(shí)治療，患者通常于短時(shí)期內(nèi)即不治死亡。目前AL的治療主要還是以化療為主。眾所周知，化療所采用的通常都是一些傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物，這些藥

2、物由于主要作用于DNA，RNA，微管蛋白等這些正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞共有組分，致使其選擇性差，毒性強(qiáng)，所產(chǎn)生的嚴(yán)重不良反應(yīng)常使患者難以耐受。同時(shí)反復(fù)非根治性劑量的化療，也容易誘生白血病細(xì)胞的耐藥，故其臨床療效也常常難以令人滿意。在過(guò)去的二十余年里，隨著人們對(duì)急性白血病分子生物學(xué)及遺傳學(xué)認(rèn)識(shí)的不斷提高，一系列與該病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的特異性分子標(biāo)志被相繼發(fā)掘[12]，引發(fā)了對(duì)以這些靶點(diǎn)為目標(biāo)的新型藥物的研發(fā)，這類藥物統(tǒng)稱為靶向藥物。相比較于傳統(tǒng)

3、化療藥，靶向藥物其優(yōu)勢(shì)在于定位準(zhǔn)確，針對(duì)性強(qiáng)，在高效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒性。靶向藥物的這一高效低毒的特點(diǎn)也使其成為了目前研究的熱點(diǎn)。開(kāi)發(fā)靶向藥物的前提是尋找到腫瘤細(xì)胞的分子靶點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，一類名為PNAS2的基因具有抑制凋亡的功能[3]。在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中我們也發(fā)現(xiàn)該基因在急性白血病細(xì)胞株及原代細(xì)胞中存在特異性的異常高表達(dá)及異常定位現(xiàn)象[47]，那么PNAS2是否可能通過(guò)抑制急性白血病細(xì)胞凋亡從而參與急性白血病的發(fā)

4、病其是否是AL治療的潛在新靶點(diǎn)？目前還沒(méi)有明確報(bào)道。在本研究中，我們就將圍繞上述推測(cè)展開(kāi)一系列論證。在尋找AL潛在分子靶點(diǎn)的同時(shí)，我們又嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)開(kāi)發(fā)AL的新的靶向藥物，希望以此為臨床上AL的治療提供新的選擇。圍繞上述目的，本研究開(kāi)展了以下三方面的工作：第一部分：旨在構(gòu)建PNAS2小干擾RNA逆轉(zhuǎn)率病毒表達(dá)載體，在將其轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞后，進(jìn)一步獲得高效抑制PNAS2表達(dá)的U937細(xì)胞株，試圖通過(guò)這一部分的工作為下一部分研究PN

5、AS2基因與急性白血病發(fā)病的關(guān)系打下基礎(chǔ)。第二部分：通過(guò)觀察PNAS2表達(dá)受抑前后，U937細(xì)胞在細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞存活率及凋亡相關(guān)因子，自噬活化因子表達(dá)水平方面的差異，對(duì)“PNAS2可能通過(guò)抑制急性白血病細(xì)胞凋亡從而參與急性白血病的發(fā)病”這一推測(cè)進(jìn)行了論證。第三部分：運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了抗PNAS2單鏈抗體表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士畢業(yè)論文5(8)DNA快速純化回收試劑盒北京鼎國(guó)生物公司(9)大腸桿菌菌株DH5α天根公司(

6、10)質(zhì)粒DNA提取試劑盒MACHEREYNAGEL(11)轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6RocheDiagnosticsGmbH(12)polybreneSigma公司(13)Trizolinvitrogen公司(14)DL2000DNAmakerTAKARA公司(15)抗PNAS2多克隆抗體SantaCruz1.2儀器儀器(1)微量加樣器Eppendf公司(2)細(xì)菌培養(yǎng)恒溫?fù)u床上海比朗儀器有限公司(3)DK－S24型電熱恒溫水浴鍋上海精密實(shí)

7、驗(yàn)設(shè)備有限公司(4)生物安全柜Esco公司(5)PCR基因擴(kuò)增儀MJResearch公司(6)Nano2000微量紫外分光光度計(jì)ThermoFisierScientific(7)二氧化碳培養(yǎng)箱QueneSystemInc2.實(shí)驗(yàn)方法2.實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均置于37℃，含5％CO2的培養(yǎng)

8、箱中孵育。每23天傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行。2.2pSIRENRetroQPNAS2的構(gòu)建pSIRENRetroQPNAS2的構(gòu)建2.2.1RNA干擾載體信息干擾載體信息本部分所采用的RNA干擾空載體為pSIRENRetroQ載體，該載體為一經(jīng)典的逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體，擁有LTR，包裝起始信號(hào)ψ等病毒包裝必須原件。在多克隆位點(diǎn)中，其具備BamHI和EcI酶切位點(diǎn)。經(jīng)上述兩酶作用后可使載體線性化，便于在其中插入所需片段。目的片段