慢病毒介導(dǎo)的TSC2表達(dá)降低對白血病U937細(xì)胞系的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的：研究抑癌基因TSC2（Tuberous Sclerosis Complex2）表達(dá)降低對白血病U937細(xì)胞系的生長、增殖、分化和凋亡的影響及其對 mTORC1(mammalian target of rapamycin，mTOR complex1）通路蛋白激酶及其靶分子活性的影響，揭示急性白血病發(fā)生的新機(jī)制。
　　方法：選擇TSC2高表達(dá)的U937細(xì)胞，通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)TSC2基因表達(dá)，篩選出GFP陽性率高

2、的細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用CCK-8法和細(xì)胞克隆形成能力實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖活力；用 PI（碘化丙啶）標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分化；采用 AnnexinV-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；通過蛋白印記實(shí)驗(yàn)，檢測TSC2表達(dá)下調(diào)對mTORC1信號通路蛋白活性的影響；采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測TSC2基因低表達(dá)對mTORC1通路下游靶基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：⑴慢病毒感染U937細(xì)胞后，實(shí)時(shí)定量PC

3、R方法檢測TSC2 mRNA的表達(dá)，干擾效率為71.7％；Western blot方法檢測蛋白表達(dá)，可見TSC2蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)。⑵下調(diào)TSC2基因表達(dá)對U937細(xì)胞的生物學(xué)作用：CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， TSC2基因表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，與未感染組細(xì)胞（空白對照）相比，實(shí)驗(yàn)組增殖活性增強(qiáng)了(5.15±0.72)倍，空載病毒組增殖活性增強(qiáng)了(1.92±0.63)倍，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞克隆

4、形成能力實(shí)驗(yàn)表明，與空載病毒對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞集落形成能力明顯增強(qiáng)（P<0.05）；細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空病毒組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G1期比例明顯降低（P<0.05），G2/M期細(xì)胞比例增高（P<0.05），S期比例增高（P<0.05）；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分化結(jié)果表明，與空載病毒對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CD13、CD33、CD11b、CD15、CD14、CD64表達(dá)無明顯變化；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，TSC2表達(dá)降低對細(xì)胞凋

5、亡無明顯改變（P>0.05）。⑶TSC2基因表達(dá)下調(diào)對mTORC1通路蛋白的影響：Western blot方法檢測mTOR及其下游分子的表達(dá)結(jié)果表明，TSC2表達(dá)下調(diào)后，mTOR總蛋白未見明顯變化，而磷酸化p-mTOR(Ser2448)表達(dá)升高；底物激酶P70S6K和4EBP1總蛋白未見明顯變化，但是活性形式p-P70S6K(Thr389)和p-4EBP1(Thr37/46)的表達(dá)明顯升高；AKT總蛋白及活性形式的p-AKT的表達(dá)未見明