凋亡相關(guān)蛋白PNAS-2參與白血病發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的和意義：PNAS-2 是一種凋亡相關(guān)基因，本實(shí)驗(yàn)室初步研究發(fā)現(xiàn)其可能參與白血病起病。我們試圖通過研究該蛋白在不同細(xì)胞中表達(dá)量和定位的差異及藥物處理前后兩者的變化以探尋PNAS-2蛋白參與白血病起病的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果： 第一部分，PNAS-2 單克隆抗體的制備和初步鑒定。根據(jù)PNAS-2 一級(jí)結(jié)構(gòu)推測二級(jí)結(jié)構(gòu)，選取符合條件的肽段作為抗原決定簇，化學(xué)合成后和BSA 偶聯(lián)；通過動(dòng)物免疫，細(xì)胞融合，有限稀釋克隆化，腹水

2、擴(kuò)增獲得敏感性高，特異性好的單克隆抗體及分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株S-31-7。在Wstern蛋白定量研究及免疫熒光定位研究實(shí)驗(yàn)中效果理想，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠工具。 第二部分，PNAS-2蛋白在細(xì)胞中表達(dá)和定位的研究。我們運(yùn)用上述獲得的PNAS-2單抗檢測該蛋白在不同細(xì)胞中表達(dá)量和定位的差異。研究發(fā)現(xiàn)PNAS-2蛋白在白血病細(xì)胞株中表達(dá)量較人類非腫瘤細(xì)胞株高，在白血病初發(fā)患者的原代細(xì)胞中，其蛋白表達(dá)較緩解及非腫瘤患者高；且在白血病

3、細(xì)胞株及白血病初發(fā)、復(fù)發(fā)患者的原代細(xì)胞中，其定位與非腫瘤細(xì)胞株及非腫瘤患者原代細(xì)胞中的定位有明顯差異。 第三部分，PNAS-2蛋白抑制白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。比較U937細(xì)胞株中抑制PNAS-2 表達(dá)的RNA 干擾組及對(duì)照組間凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)差異，探討其抑制白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，抑制PNAS-2蛋白表達(dá)后，細(xì)胞株中的GraB，AIF，P53，Rb，caspase3蛋白的表達(dá)量均明顯上升，說明抑

4、制PNAS-2蛋白的表達(dá)有促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤生長的作用。且PNAS-2 通過AIF 介導(dǎo)的非caspase 依賴途徑及caspase 依賴途徑中的GraB-Perforin 通路抑制細(xì)胞凋亡。 第四部分，磷酸氯喹對(duì)白血病細(xì)胞的影響及與PNAS-2蛋白的關(guān)系。磷酸氯喹是一種生物膜穩(wěn)定藥物，我們發(fā)現(xiàn)其對(duì)白血病細(xì)胞株有誘導(dǎo)凋亡的作用，并且發(fā)現(xiàn)藥物處理后細(xì)胞內(nèi)PNAS-2的異常定位能夠被糾正，并且表達(dá)量也相應(yīng)減少。白血病患者的原代細(xì)

5、胞經(jīng)同樣處理，也可得到類似效果。本文推斷，PNAS-2是一種凋亡抑制蛋白，在白血病細(xì)胞中可能存在多泡體膜穩(wěn)定性下降的異?，F(xiàn)象，從而使得原本應(yīng)局限于MVB膜上的PNAS-2發(fā)生異常定位及過量表達(dá)，其抑制細(xì)胞凋亡的作用被放大，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。 結(jié)論：PNAS-2蛋白在白血病細(xì)胞中存在異常定位和過量表達(dá)，其通過MVB途徑抑制了細(xì)胞凋亡而參與了白血病的起病。磷酸氯喹能夠增加MVB膜穩(wěn)定性，糾正PNAS-2蛋白的異常定位和過量表達(dá)