裂解型腺病毒基因治療人肝癌細胞及其轉移瘤的體內外實驗研究.pdf

1、本文研究目的：構建裂解型腺病毒載體，研究其體內外治療人肝癌細胞及其轉移瘤的效果和機理。 方法：抽提QBI-293A細胞的基因組DNA，根據(jù)Genebank公布的第5血清型腺病毒(Ad5)的E1A基因序列設計并合成一對引物，采用PCR技術克隆人E1A基因，將其亞克隆到pUCm-T載體并鑒定。以測序正確的pUCm-T-E1A為模板，酶切目的基因片段，連接到轉移載體pAdTrack-CMV上，形成重組載體pAdTrack-CMV-E1

2、A。重組載體經(jīng)PmeI酶切后與pAdEasy一1腺病毒載體在BJ5I83大腸桿菌中同源重組，得到的重組腺病毒載體pAdeasy．1-pAdTrack-CMV-ElA經(jīng)PacI酶切后脂質體轉染QBI-293A細胞，獲得重組裂解型腺病毒rAd-E1A。rAd-E1A感染人肝癌細胞HepG2，SMMC一7721和人正常肝細胞HL-7702，顯微鏡下觀察rAd-E1A對細胞的裂解效果，MTT法和流式細胞儀檢測rAd-E1A對細胞生長抑制和誘導凋

3、亡作用。RT-PCR和Western-blotting鑒定rAd-E1A的作用機理。在nu／nu裸鼠皮下建立SMMC一7721人肝癌的動物模型，觀察rAd-E1A基因治療肝癌的效果，并進一步研究其機理。在小白鼠腹水型肝癌H22基因治療模型中，檢測rAd-E1A對小白鼠免疫器官(胸腺，脾臟)和免疫細胞(白細胞，淋巴細胞，單核細胞，中性粒細胞)的影響。MTT法檢測rAd-E1A對人臍靜脈內皮細胞ECV304生長的影響，ELISA檢測對ECV

4、304細胞分泌血管內皮生長因子VEGF的影響，Western-blotting鑒定rAd-E1A對ECV304細胞的NF-r．_B。 結果：成功獲得1194bp的E1A基因及其上游開放可譯框架(ORF)，序列測定結果與GenBank報道的完全一致。并成功構建了裂解型腺病毒rAd-E1A，可顯著裂解人肝癌細胞HepG2，SMMC-772l，誘導細胞的凋亡，抑制細胞生長，而對人正常肝細胞HL-7702作用較弱。rAd-ElA可體內抑

5、制人肝癌和小鼠腹水型肝癌的生長，且對小白鼠的免疫器官沒有抑制，同時可提高中性粒細胞和單核細胞的數(shù)目。rAd-E1A在人肝癌細胞中上調Fas，Bax，下調survivin和Bcl-2的表達，另外在人肝癌組織中上調凋亡相關因子p53，p27，Caspase-3，下調血管生成相關因子VEGF和CD34的表達。rAd-ElA明顯抑制ECV304內皮細胞增殖和下調vEGF和NF-κB的表達。 結論：裂解型腺病毒rAd-E1A可在體外裂解人