花生資源黃酮含量分析和黃酮醇合成酶基因克隆.pdf

1、黃酮類化合物是花生種子中重要功能性成份，其含量高低影響花生的品質(zhì)，繼而影響花生的保健價值。目前，花生種子黃酮研究僅在黃酮種類鑒定、資源篩選及QTL初定位上有所報道，但對黃酮含量的鑒定及黃酮合成基因克隆等方面的深入研究較少。本研究通過測定花生品種中總黃酮含量篩選高黃酮種質(zhì);利用同源克隆法和RACE技術(shù)克隆花生黃酮醇合成酶(FLS)相關(guān)基因，并進(jìn)行抗逆境響應(yīng)和種子發(fā)育表達(dá)研究，確定與種子黃酮含量相關(guān)的FLS成員。
　　主要研究結(jié)果如下

2、:
　　1.測定河北花生地方品種種子總黃酮含量，篩選到花生種子中總黃酮含量在3.50mg RT/g FW以上的種質(zhì)8份:鹽山烏鴉窩、任丘一窩猴、隆堯一窩猴、辛農(nóng)一窩猴、香河一窩猴、灤平大花生、大名一把揪、蘆龍小花生?；ㄉN胚中總黃酮含量在0.60mg RT/g FW以上的種質(zhì)兩份:平山中粒、深縣小拔果。
　　2.相關(guān)性分析表明花生黃酮含量與可溶性蛋白含量顯著負(fù)相關(guān)(Pearson:-0.254，α=0.028，P＜0.05)

3、，與每株莢果數(shù)顯著負(fù)相關(guān)(Pearson:-0.244，α=0.034，P＜0.05)，與脂肪含量、株高、側(cè)枝長、側(cè)枝數(shù)、百果重、百仁重、網(wǎng)紋、果殼厚度等性狀呈負(fù)相關(guān)，未達(dá)顯著水平，與糖含量正相關(guān)不顯著。
　　3.獲得與花生種子總黃酮含量顯著相關(guān)的4個EST-SSR:GM2284、GM2156、GM2067和GM1878，其中GM2156與花生種子總黃酮含量顯著正相關(guān)，其它三個顯著負(fù)相關(guān)。
　　4.從栽培花生種子中克隆到6個

4、花生黃酮醇合成酶基因(AhFLSs)，生物信息學(xué)分析表明均含有FLS特征結(jié)構(gòu)域:N-端的DIOX_N，C-端的2OG-FeⅡ_Oxy;6AhFLSs均為親水蛋白質(zhì)、無跨膜區(qū)和信號肽;將6個花生黃酮醇合成酶與其它植物FLS進(jìn)行比對，AhFLSs與大豆的各FLS同源性最高，其次是蒺藜苜蓿。AhFLS1與大豆（XM_0035480333）的同源性在80％，AhFLS6與大豆和蒺藜苜蓿的同源性在75％。
　　5.測定花生幼苗期和開花期各器

5、官、不同發(fā)育時期種子中的楊梅黃酮、槲皮素、山奈酚等三種黃酮醇含量。在花生的根、莖、葉、花及種子中，槲皮素含量高于楊梅黃酮和山奈酚，是主要的黃酮醇類物質(zhì)。幼苗期的葉片中三種黃酮醇類物質(zhì)含量高于根、莖;開花期的花中的黃酮醇類物質(zhì)含量高于根、莖、葉;在種子發(fā)育及干燥后熟期，三種黃酮醇類物質(zhì)含量持續(xù)上升，到完全干燥成熟期，達(dá)到最大值。熒光實(shí)時定量分析AhFLS2、AhFLS3、AhFLS4、AhFLS5、AhFLS6在各樣品中的表達(dá)情況，在根、

6、莖、葉、和花中，AhFLS2表達(dá)量最高，在種子開始膨大的R5到R8完全成熟期間，AhFLS4表達(dá)高于其它AhFLSs成員，進(jìn)入干燥成熟期，AhFLS6表達(dá)量持續(xù)升高，高于其它AhFLSs成員，在三種黃酮醇類物質(zhì)含量達(dá)到最高值的干燥后熟期達(dá)到最大值。結(jié)果表明各AhFLSs成員表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育時間特異性。
　　6.低溫、高溫、鹽、干旱、重金屬、紫外線和激素處理花生幼苗，測定其楊梅黃酮、槲皮素、山奈酚等三種黃酮醇含量，槲皮素是三

7、者中主要的黃酮醇類物質(zhì)，含量最高，但在脅迫過程中變化幅度最大的是山奈酚含量。熒光實(shí)時定量分析AhFLSs的表達(dá)情況，AhFLS2、AhFLS4和AhFLS6的表達(dá)量高，處理24h內(nèi)波動幅度也高于AhFLS3和AhFLS5，3成員對脅迫的響應(yīng)具有脅迫種類差異。
　　7.測定秦皇島光秧、印度窄葉、平度中粒、鹽山烏鴉窩、冀花16號、花育22號、PI497318、PI482120、PI292950的楊梅黃酮、槲皮素、山奈酚等三種黃酮醇含量

8、，槲皮素是花生種子內(nèi)主要的黃酮醇物質(zhì)，山奈酚含量最低，3種黃酮醇總含量在113.19-233.225μg/g FW之間;熒光實(shí)時定量分析AhFLS2、AhFLS3、AhFLS4、AhFLS5、AhFLS6在各品種種子中的表達(dá)情況，AhFLS2和AhFLS6在9個花生品種中的表達(dá)量高于其它3個AhFLSs，且有品種差異性，在冀花16號和秦皇島光秧中，AhFLS2比AhFLS6表達(dá)量高，在其它7個品種中均是AhFLS6的表達(dá)水平最高。