苦蕎黃酮醇合酶FLS2和FLS3的基因克隆及其最適底物分析.pdf

1、苦蕎(Fagopyrum tatarium)是一種藥食兩用植物，不僅具有豐富的營養(yǎng)，而且富含以蘆丁為代表的黃酮醇類化合物。黃酮醇合成是植物苯丙烷代謝途徑的支路之一，在黃酮醇合酶(Flavonols synthetase，F(xiàn)LS)的催化下，二氫槲皮素(Dihyquercetin，DHQ)、二氫山奈酚(Dihykaempferol，DHK)和二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DHM)等3種二氫黃酮醇可轉(zhuǎn)化為槲皮素、山奈酚和楊梅素

2、等3種黃酮醇，其中槲皮素經(jīng)糖基化后轉(zhuǎn)變?yōu)樘J丁。已有研究表明，苦蕎FtFLS基因在染色體上存在多拷貝，預(yù)示具有不同的FtFLS同源蛋白參與了苦蕎蘆丁的合成。本研究基于苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了苦蕎黃酮醇合酶同源蛋白的兩條基因FtFLS2和FtFLS3，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;實現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)，比較了FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3等3個重組苦蕎黃酮醇合酶對3種底物的動力學(xué)參數(shù)，分析了它們在苦蕎蘆丁合成中的最適底物。本研究取得

3、了以下主要結(jié)果:
　　1.采用同源克隆和RACE技術(shù)，獲得2條苦蕎黃酮醇合酶同源基因的ORF序列，命名為FtFLS2和FtFLS3。序列分析表明，F(xiàn)tFLS2的ORF為996 bp，編碼331個氨基酸殘基的蛋白，推導(dǎo)的FtFLS2蛋白相對分子量為37.8 KDa，分子式為C1771H2651N451O502S10， pI為5.52; FtFLS3的ORF為1008 bp，編碼335個氨基酸殘基的蛋白，推導(dǎo)的FtFLS3蛋白相對分子

4、量為38.1 KDa，分子式為C1723H2689N449O509S10， pI為5.74。Blast分析表明，F(xiàn)tFLS2和FtFLS3與已知的FtFLS1(GenBank ID: JX401285.1)的相似性分別為97％和77％。多重序列比對顯示，F(xiàn)tFLS2和FtFLS3含有2-ODD家族蛋白的保守功能區(qū)Conserved domainA、Conserveddomain B、Fe2+離子結(jié)合位點和2-酮戊二酸結(jié)合位點，屬于典型的

5、2-酮戊二酸依賴型的雙加氧酶。同源進(jìn)化樹分析表明，F(xiàn)tFLS2與葡萄(Vitis vinifera)的VvFLS(GenBankID: AB213566)聚為簇Ⅲ，F(xiàn)tFLS3與FtFLS1和甜蕎(Fagopyrum esculentum)FeFLS聚為簇Ⅰ，推測它們可能具有不同的催化特征。
　　2.構(gòu)建FtFLS2和FtFLS3的原核表達(dá)載體pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3，并在大腸桿菌中實現(xiàn)的可溶性表達(dá)。SD

6、S-PAGE分析表明，重組FtFLS2和FtFLS3蛋白分子量分別為37.8 KDa和38.1 KDa。pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3，及本課題組已獲得的基因工程菌pET30-FtFLS1，均置于1 mmol/L IPTG，25℃條件下，誘導(dǎo)10h。菌體經(jīng)超聲波破碎，鎳親和層析，獲得電泳純FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3重組蛋白。薄層層析(TLC)分析表明，3個FtFLS均具有將DHQ轉(zhuǎn)化為槲皮素的活性。在1

7、00μmol/L DHQ的反應(yīng)液中，12.5μg的三種FtFLS蛋白均在15min內(nèi)催化生成的槲皮素量與反應(yīng)時間呈直線相關(guān)。采用雙倒數(shù)作圖法，測定3個重組FtFLS對DHQ、DHK和DHM的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示:對3種二氫黃酮醇的米氏常數(shù)，F(xiàn)tFLS1分別為KmDHQ=594.17μmol/L(VmaxDHQ=42.55μmol/L·min),KmDHK=1257.18μmol/L(VmaxDHQ=25.53μmol/L·min

8、)和KmDHM=1516.36μmol/L(VmaxDHM=17.76μmol/L·min); FtFLS2分別為KmDHQ=8411.27μmol/L(VmaxDHQ=10.25μmol/L·min),KmDHK=23646.74μmol/L(VmaxDHQ=13.59μmol/L·min)和KmDHM=21583.23μmol/L(VmxDHM=12.15μmol/ L·min); FtFLS3分別為KmDHQ=6478.21μmo