茶樹黃酮醇糖苷積累的研究及CsFLS基因功能的驗(yàn)證.pdf

1、茶樹多酚類物質(zhì)是茶湯風(fēng)味形成的主要成分，其中黃酮醇糖苷在茶的澀味中扮演著重要角色。茶樹中游離的黃酮醇很少，多與糖基結(jié)合，形成黃酮醇糖苷類形式存在。黃酮醇合成酶基因（FLS）是黃酮醇合成的直接關(guān)鍵酶，與黃酮醇糖苷的積累是緊密相關(guān)的。本文首先對茶樹中的黃酮醇糖苷進(jìn)行了定性和定量分析，為進(jìn)一步探索茶樹中黃酮醇糖苷含量變化機(jī)理，本文還對茶樹黃酮類物質(zhì)積累的關(guān)鍵基因黃酮醇合成酶（FLS）的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下：
　　1．茶樹中黃

2、酮醇糖苷的定性和定量分析。利用HPLC-TOF-MS鑒定了茶樹鮮葉中15種黃酮醇糖苷；利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立了這些黃酮醇糖苷的定量方法；并通過六個(gè)黃酮醇糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品對定量方法進(jìn)行了評估，結(jié)果表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，回歸方程都具有很好的線性關(guān)系(R2>0.99)；最低檢測限和最低定量限分別小于0.01和0.03ng；回收率在90％和105%之間；保留時(shí)間和峰面積變化的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差分別小于0.15%和3.9%；

3、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差分別小于0.26%和4%。表明該方法具有較高的靈敏度、良好的精密度和重現(xiàn)性。
　　利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立的定量方法，研究了四個(gè)不同茶樹品種不同組織發(fā)育階段的黃酮醇糖苷的含量變化。相對定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃酮醇單糖苷，雙糖苷和三糖苷主要積累在嫩葉中，少量積累在芽、成熟葉和幼莖中，其中槲皮素-3-O-蕓香糖苷在成熟葉和幼莖中含量也很高。絕對定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中6種黃酮醇糖苷在不同組織發(fā)育階段的絕對含量變

4、化與相對定量的結(jié)果一致，主要積累在嫩葉中。此外，我們還發(fā)現(xiàn)這六個(gè)黃酮醇糖苷在老莖和根中的含量極少。
　　2茶樹黃酮醇合成酶功能的研究。本文克隆了3條茶樹黃酮醇合成酶（CsFLS）基因，利用RT-PCR技術(shù)定量分析了3條CsFLS基因在不同組織發(fā)育階段和不同誘導(dǎo)處理下的表達(dá)水平差異，結(jié)果表明，3條CsFLS基因在芽、一葉、二葉、成熟葉和3幼莖中都有表達(dá)；其中CsFLS1基因在芽中表達(dá)量最高，而CsFLS2和CsFLS3基因在二葉中表

5、達(dá)量最高，它們在成熟葉和莖中表達(dá)量都較低；3條CsFLS基因的表達(dá)都受蔗糖和ABA誘導(dǎo)明顯上調(diào)，而其他處理?xiàng)l件下，CsFLS基因表達(dá)量變化都不明顯。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證它們的功能，實(shí)驗(yàn)將3條CsFLS基因整合到pRSFDuet-1載體上，構(gòu)建成帶組氨酸（His）標(biāo)簽的重組融合表達(dá)載體，并導(dǎo)入BL21大腸桿菌表達(dá)，再利用Ni柱純化獲得重組融合蛋白。HPLC體外酶活檢測結(jié)果顯示，3條重組CsFLS融合蛋白均可分別以DHK、DHQ和DHM

6、為底物催化K、Q和M的產(chǎn)生；CsFLS2融合蛋白對于DHK、DHQ和DHM的Km值分別為22.9μM，80μM和65.55μM。構(gòu)建了EHA105-pCB2004-CsFLS2載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染煙草葉片，通過除草劑篩選獲得了轉(zhuǎn)基因植株。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CsFLS2基因的煙草相比野生型，其花色明顯變淺，花青素含量明顯降低，而黃酮醇糖苷的含量增加。進(jìn)一步在本氏煙幼苗葉片組織中瞬時(shí)表達(dá)帶有GFP的CsFLS2基因，發(fā)現(xiàn)CsFLS2定位