雞TIA-1和G3BP1在應(yīng)激顆粒形成和抗病毒反應(yīng)過程中的作用.pdf

1、當(dāng)細(xì)胞暴露于各種環(huán)境應(yīng)激條件下，如亞砷酸鹽，缺氧和熱休克時(shí)，細(xì)胞終止蛋白翻譯，在細(xì)胞質(zhì)中形成儲(chǔ)存mRNA的顆粒，稱為應(yīng)激顆粒（stress granule，SG）。SG是在應(yīng)激條件下從解聚的多核糖體儲(chǔ)存位點(diǎn)釋放的mRNA，對(duì)選擇性翻譯是所必需的。當(dāng)應(yīng)激條件消失時(shí)，應(yīng)激刺激的細(xì)胞內(nèi)損傷得到修復(fù)，例如DNA損傷和錯(cuò)誤折疊蛋白的積累。RNA結(jié)合蛋白T細(xì)胞內(nèi)部抗原-1（TIA-1）和GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結(jié)合蛋白1（G3BP1）是參與SG

2、形成的重要組件。作為對(duì)環(huán)境應(yīng)激的一種保守應(yīng)答反應(yīng)， SG存在于各種物種中。然而，在雞細(xì)胞中SG形成以及TIA-1/G3BP1在雞SG裝配中的作用還沒有被闡明。本研究重點(diǎn)將對(duì)雞TIA-1/G3BP1的功能及其在病毒復(fù)制中的作用進(jìn)行研究。
　　TIA-1在調(diào)節(jié)人類細(xì)胞中前mRNA剪接，mRNA翻譯和SG形成中發(fā)揮作用。在本研究中，我們克隆雞 TIA-1（cTIA-1），結(jié)果表明外源轉(zhuǎn)染cTIA-1促進(jìn)人和雞細(xì)胞中經(jīng)典SGs的形成。具有

3、氨基末端GFP標(biāo)簽（ntGFP-cPRD）或Flag標(biāo)簽（Flag-cPRD）的cTIA-1朊蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域cPRD的過表達(dá)誘導(dǎo)典型的SG的產(chǎn)生，說明cPRD參與了SG的聚集。然而，羧基末端GFP標(biāo)簽（ctGFP-cPRD）cPRD誘導(dǎo)明顯較大的細(xì)胞質(zhì)顆粒，并且不與內(nèi)源性G3BP1共定位，CHX處理后仍保持穩(wěn)定不降解，這些結(jié)果表明這些顆粒不是典型的SGs，ctGFP標(biāo)簽影響cPRD定位。在外界環(huán)境應(yīng)激下，內(nèi)源性cTIA-1被募集到的雞細(xì)

4、胞的SG中，在熱休克處理下，雞心臟中出現(xiàn)明顯SG顆粒。以上結(jié)果表明：cTIA-1在雞細(xì)胞中的經(jīng)典SG形成中起作用，cPRD在SG聚集過程中發(fā)揮重要作用。
　　G3BP1是SGs的重要組件，能夠啟動(dòng)組裝SGs形成多聚體。為掌握G3BP1在如何作用于雞細(xì)胞中SG形成，以及雞G3BP1（cG3BP1）在新城疫病毒（NDV）感染誘導(dǎo)SG形成過程中的作用，用NDV感染HeLa細(xì)胞，免疫熒光檢測內(nèi)源性G3BP1的定位，結(jié)果表明G3BP1呈現(xiàn)典

5、型的點(diǎn)狀熒光，但不與病毒P蛋白共定位。將雞G3BP1分別轉(zhuǎn)染至HeLa，DF-1和CEF后，以不同應(yīng)激處理之后均能在細(xì)胞中觀察到SG。外源轉(zhuǎn)染cG3BP1和各分段結(jié)構(gòu)域后以不同應(yīng)激處理之后觀察與內(nèi)源性SG標(biāo)志物共定位現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G3BP1的A結(jié)構(gòu)域（NTF2樣結(jié)構(gòu)域）不能被招募到SGs中，并且抑制原有SGs的形成，D區(qū)為RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，單獨(dú)表達(dá)D區(qū)能夠誘導(dǎo)SG形成，說明cG3BP1的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)奂陵P(guān)重要。最后轉(zhuǎn)染G3BP1