ERC(N5)小肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC增殖、侵襲作用的研究.pdf

1、目的:
　　 1、分析ERC(N5)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEe結(jié)合的情況
　　 2、觀察ERC(N5)對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡及侵襲作用的影響
　　 方法:
　　 1、ERC(N5)小肽的設(shè)計(jì)與合成
　　 將蛇毒鋸鱗蝰素( Echistatin，Ech)氨基酸序列中的RGD模體及其周邊序列直接與C末端序列結(jié)合，突變第五個(gè)氨基酸(D—N)并適當(dāng)減少氨基酸的數(shù)目，設(shè)計(jì)成含16個(gè)氨基酸的小肽，其序列為AR

2、GDNMPRNPHKGPAT，命名為ERC(N5)，由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成。
　　 2、ERC(N5)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的結(jié)合情況分析
　　 利用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面αvβ3的表達(dá)情況；分別將ERC(N5)、Ech、FITC-LM609(整合素αvβ3的單克隆抗體)與HUVEC細(xì)胞共同孵育后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞率，分析ERC(N5)

3、/Ech與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合αvβ3的情況。
　　 3、ERC(N5)對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡、侵襲作用的研究
　　 置顯微鏡觀察ERC(N5)處理后的HUVEC形態(tài)變化；通過(guò)AO/EB對(duì)細(xì)胞核染色觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)ERC(N5)對(duì)HUVEC凋亡率的影響；用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡基因Caspase-3表達(dá)。利用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Matrige

4、l侵襲實(shí)驗(yàn)觀察ERC(N5)對(duì)HUVEC遷移、侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞表面整合素αvβ3表達(dá)量為68.3％。
　　 2、ERC(N5)、FITC-LM609與HUVEC細(xì)胞共孵育后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞率隨著ERC(N5)濃度的增大而逐漸減小。終濃度為16μM的ERC(N5)與Ech分別與HUVEC孵育后，其αvβ3陽(yáng)性細(xì)胞率分別為l.2％和26.8％。
　

5、　 3、HUVEC經(jīng)ERC(N5)作用24h后，細(xì)胞變圓、間隙增大、有細(xì)胞碎片出現(xiàn)。經(jīng)AO/EB染色后，出現(xiàn)核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀的早期凋亡細(xì)胞和核染色質(zhì)為橘紅色的晚期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示，ERC(N5)作用HUVEC細(xì)胞后，凋亡率增加5倍。
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示在經(jīng)ERC(N5)處理后Caspase-3基因表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，且有劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 5、ERC(N5)作用下，HUVEC細(xì)胞的