多壁碳納米管對人臍靜脈內皮細胞損傷作用的研究.pdf

1、目的：納米顆粒具有獨特的物理、化學和生物特性，越來越廣泛地被應用于生產生活的各個領域中。它們在這些領域的應用帶來了巨大的經濟效益，但同時也產生潛在的生物安全性與環(huán)境安全性等問題而引起世界范圍的廣泛關注。心血管疾病是嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病，而空氣細微顆粒物與心血管疾病之間的密切關系已得到證實，有研究表明碳納米顆粒進入肺部后能轉移到心血管系統(tǒng)，因此納米顆粒的心血管毒性格外引入注目。一些研究結果顯示納米顆?？梢鹨幌盗信c細胞代謝、凋

2、亡、細胞周期、應激反應、細胞信號轉導和炎癥反應相關基因的mRNA水平的改變。其損傷機制尚無定論，目前研究較多的是氧化應激機制。血管內皮細胞為覆蓋于血管內膜表面的單層扁平或多角形的細胞，它的損傷與功能紊亂和多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有密切的關系。因此，研究目前應用最多的納米材料之一，多壁碳納米管(MWCNTs)對血管內皮細胞的損傷及其機制，對了解納米材料在心血管疾病方面的潛在危害有著積極的意義。本實驗采用體外實驗探索MWCNTs引起血管細胞

3、的損傷作用及其機制。觀察MWCNTs對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)細胞活力、DNA損傷作用、ROS水平、過氧化反應和炎癥因子分泌的影響。為了模擬體內的復雜環(huán)境，將HUVECs和人單核細胞THP-1細胞共培養(yǎng)后，觀察MWCNTs對HUVECs的毒性作用，為評價MWCNTs的潛在心血管毒性及其作用機制提供實驗依據。
　　 方法：⑴用臺盼藍染色法觀察不同濃度(0.2、1、2、5、10、20、50、100μg/ml)的MWCNTs對

4、HUVECs的存活率的影響，設定本實驗的劑量范圍；用倒置顯微鏡觀察MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細胞形態(tài)變化；用透射電鏡觀察MWCNTs(20μg/ml)處理后HUVECs24h細胞吞噬MWCNTs的情況及細胞形態(tài)學改變；用檢測細胞凋亡的試劑盒檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細胞凋亡的情況；用免疫熒光法觀察MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細胞中磷酸

5、化組蛋白H2AX(yH2AX)焦點形成情況，比較細胞核內焦點形成的數量及熒光強度。免疫熒光顯微鏡圖片用Image Pro Plus軟件進行yH2AX焦點定量計數。⑵用DCFH-DA法檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細胞內ROS水平的變化情況；用硫代巴比妥酸法(TBA法)測定細胞內MDA的含量、黃嘌呤氧化酶法測SOD活力，通過還原型谷胱甘肽(GSH)的消耗量來測定GSH-Px活力。⑶用酶聯免疫試劑盒(ELI

6、SA)檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α的變化。⑷NAC(6 mM)預處理后，1)用試劑盒檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細胞凋亡的情況。2)用DCFH-DA法檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細胞內的ROS水平變化。3)用免疫熒光技術檢測MWCNTs(5vg/ml)處理后HUVECs細胞yH2AX焦點形成情況，與N

7、AC預處理前進行比較。⑸將HUVECs與THP-1細胞共培養(yǎng)后，用DCFH-DA法檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理共培養(yǎng)細胞系后HUVECs內的ROS水平變化。與未共培養(yǎng)時的結果比較。⑹所有結果采用SPSS統(tǒng)計軟件分析。
　　 結果：①0、0.5、2、5、10、20μg/ml MWCNTs作用下，HUVECs細胞的存活率均在70％以上，隨著染毒濃度的增高，細胞存活率下降，并存在劑量和時間依賴關系；正常HUVEC

8、s細胞生長狀態(tài)良好，呈連續(xù)分布，互不重疊，細胞形狀規(guī)則，呈典型鋪路石狀排列。隨著MWCNTs濃度增加，死亡懸浮細胞增多，且細胞形態(tài)改變明顯。透射電鏡顯示20μg/ml染毒組細胞胞漿中空泡狀結構增多，并吞噬有MWCNTs，細胞核不規(guī)則，出現核皺縮；MWCNTs作用24h后，各濃度的MWCNTs都促進了HUVECs細胞的凋亡，與對照組比較有顯著性差異；免疫熒光實驗發(fā)現，空白對照組中大部分(>80％)細胞核內無yH2AX的存在，只有少數細胞核

9、內可發(fā)現少許yH2AX。各劑量MWCNTs處理細胞后，均可引起細胞核內yH2AX焦點形成，并有劑量依賴性。與空白對照組相比有顯著性差異。②細胞內的ROS水平隨著MWCNTs濃度升高而升高。20μg/ml MWCNTs能引起細胞ROS水平的顯著增高，且有時間依賴關系；隨著MWCNTs濃度的增高，HUVECs細胞內MDA含量顯著增加，其中5、20μg/ml組與對照組比較有顯著性差異。當MWCNTs濃度較低時(0.5、5μg/ml)，細胞內G

10、SH-Px增加，與對照組比較有顯著性差異，而當MWCNTs濃度升高到20μg/ml時GSH-Px又降低。SOD的變化與GSH-Px的變化相似。③MWCNTs對HUVECs細胞炎癥因子TNF-α的產生沒有明顯的影響。④經6 mM NAC預處理后，1)細胞凋亡率與未處理的染毒組相比均有降低，其中0.5μg/ml劑量組與同劑量單純MWCNTs處理組相比具有顯著性差異。2)與單純MWCNTs處理組相比，形成γH2AX焦點的陽性細胞明顯減少，具有

11、顯著性差異(p<0.01)。3)細胞內ROS水平明顯降低，其中5、20μg/ml劑量組與同劑量單純MWCNTs處理組相比具有顯著性差異。⑤HUVECs與THP-1細胞共培養(yǎng)后，HUVECs中的ROS含量均比未共培養(yǎng)時的ROS含量增加，20μg/ml組有顯著差異。
　　 結論：MWCNTs能進入HUVECs細胞，降低細胞的存活力，誘導細胞凋亡和DNA損傷，并伴有ROS水平升高和細胞氧化還原失衡。提示MWCNTs誘導HUVECs損傷