柔嫰艾美耳球蟲嵌合抗原的真核質(zhì)粒構(gòu)建及免疫保護(hù)作用分析.pdf

1、艾美耳球蟲（Eimeria）是一類專性胞內(nèi)寄生性頂復(fù)門原蟲，可以嚴(yán)重危害集約化養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)。目前，雞球蟲病的主要防治手段是藥物和活卵囊疫苗，但二者都存在不可逾越的障礙，這就需要尋求雞球蟲疫苗發(fā)展的新方向。
　　本試驗(yàn)為了研究雞球蟲基因工程疫苗，以致病力最強(qiáng)的柔嫩艾美耳球蟲為研究對象，選取其四個關(guān)鍵的入侵相關(guān)蛋白分子（頂膜抗原及棒狀體頸部蛋白），利用生物信息學(xué)分析其關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，利用重疊延伸PCR技術(shù)連接功能結(jié)構(gòu)域的表達(dá)基因，將其嵌

2、合為一個多表位的抗原，對該嵌合抗原進(jìn)行真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，制備DNA疫苗，并對其免疫保護(hù)效果進(jìn)行評價分析。
　　首先利用生物信息學(xué)與比較基因組學(xué)技術(shù)，注釋拼接到柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)入侵相關(guān)蛋白（EtAMA1，EtMA1，EtMA2和EtRON2）的基因序列，以預(yù)測的序列設(shè)計(jì)引物，以E.tenella（廣東株）第二代裂殖子總RNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出這四種基因的開放閱讀框(ORF)序列;通過在線軟件，對其進(jìn)行生物

3、信息學(xué)分析;再分別設(shè)計(jì)引物，從這四種基因的全長序列中擴(kuò)增胞外區(qū)的DⅡ結(jié)構(gòu)域，并通過SOEPCR技術(shù)將其構(gòu)建成一個可串聯(lián)表達(dá)的嵌合抗原基因片段，其大小為1452bp，編碼484個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為50.84KD，等電點(diǎn)為8.26。
　　將嵌合抗原CA片段插入到真核表達(dá)載體pVAXⅠ中，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒。將所構(gòu)建的pVAXⅠ-CA重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，同時肌肉注射雞左腿，檢測其體內(nèi)外表達(dá)情況，結(jié)果表明該重組質(zhì)粒在真

4、核細(xì)胞及雞體內(nèi)均有轉(zhuǎn)錄;通過RealTimePCR對質(zhì)粒免疫機(jī)體后3d、6d和10d的肌肉組織RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平差異檢測顯示，CA在免疫后6d轉(zhuǎn)錄水平最高。
　　將真核質(zhì)粒pVAXⅠ-CA作為DNA疫苗對雞體進(jìn)行免疫，分析評價其免疫保護(hù)效果。將150只3日齡雞，分為6組，設(shè)低中高三個劑量組、空載體對照組、感染非免疫組、非感染非免疫組，在3日齡和10日齡進(jìn)行一免和二免，二免后10d經(jīng)口感染5×104個新鮮孢子化卵囊，感染后7d撲殺試

5、驗(yàn)雞，評價抗球蟲指數(shù)。利用RealTimePCR對免疫前、一免后、二免后雞的IFN-γ、IL-2和IL-12的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:免疫組的ACI值均高于對照組，說明pVAXⅠ-CA起到了抗球蟲感染的作用;IL-2、IL-12和IFN-γ在雞3日齡免疫前表達(dá)量都很低，免疫后免疫組的細(xì)胞因子表達(dá)量均高于對照組，表明嵌合抗原CA可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗球蟲細(xì)胞免疫反應(yīng);結(jié)合ACI值與細(xì)胞因子評價顯示:高劑量（100μg