人子宮內(nèi)膜中S100A11調(diào)節(jié)胚胎著床的分子機(jī)制研究.pdf

1、胚胎著床是指胚泡進(jìn)入子宮腔后與子宮內(nèi)膜粘附，并逐漸埋入子宮內(nèi)膜的過程。近年來，眾多學(xué)者從細(xì)胞因子、粘附因子及其配基、免疫、激素等方面對胚胎著床進(jìn)行了廣泛而深入的研究，取得了巨大的成功，發(fā)現(xiàn)了許多新的因子和新的信息。本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行“蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略在早期妊娠流產(chǎn)以及卵泡發(fā)育潛能研究中的應(yīng)用”相關(guān)研究時，發(fā)現(xiàn)早期妊娠丟失的絨毛組織中S100A11表達(dá)水平顯著降低。該結(jié)論后被免疫組織化學(xué)證實(shí)。該研究暗示，S100A11可能在早期胚胎著床中扮

2、演重要角色。S100A11是S100蛋白家族的成員之一。該家族成員是是一組低分子量的鈣結(jié)合蛋白，與鈣調(diào)蛋白及其他EF手型鈣離子結(jié)合蛋白具有高度同源性。
　　 本文從臨床調(diào)查、S100A11靶向性siRNA干擾的動物模型以及細(xì)胞學(xué)水平三方面，分別對子宮內(nèi)膜中鈣調(diào)蛋白S100A11表達(dá)、分布，以及其在胚胎著床中上下游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)：分泌中期的子宮內(nèi)膜中，S100A11大量分布于腔上皮，腺上皮；臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在難免流產(chǎn)的

3、蛻膜組織中、不明原因不孕患者子宮內(nèi)膜組織中，S100A11表達(dá)降低。而在管性不孕行IVF-ET治療之后妊娠失敗的患者子宮內(nèi)膜調(diào)查結(jié)果中，S100A11表達(dá)顯著性降低。為進(jìn)一步分析子宮內(nèi)膜中S100A11在胚胎著床過程中的作用，我們利用在體小鼠動物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)合靶向性siRNA干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)S100A11的低表達(dá)水平能夠直接影響胚胎的種植率，以及滋養(yǎng)細(xì)胞的粘附率。在對與胚胎種植息息相關(guān)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞容受和免疫耐受等的分子標(biāo)記物的

4、研究中，我們發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)水平的S100A11能夠使子宮內(nèi)膜容受和免疫耐受相關(guān)的重要的標(biāo)記分子發(fā)生顯著性地改變，從而不利于子宮內(nèi)膜容受及免疫耐受的形成。在對S100A11介導(dǎo)的胚胎著床分子機(jī)制研究中，我們發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜中的S100A11并不受雌激素、孕激素以及促絨毛膜性腺激素等的調(diào)控，相反表皮生長因子(EGF)能夠上調(diào)S100A11的表達(dá)。而該現(xiàn)象的生物學(xué)意義在于，S100A11能夠促進(jìn)EGF誘導(dǎo)產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣離子的升高。具體機(jī)制是：定位于

5、細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域的S100A11作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中鈣離子通道，參與了調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池中鈣離子的釋放和攝取，從而使內(nèi)膜細(xì)胞維持在一個動態(tài)的鈣平衡狀態(tài)，有利于胚胎種植。
　　 第一部分S100A11在人子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)、分布
　　 目的：確認(rèn)S100A11在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞上的表達(dá)及分布，分析難免流產(chǎn)病人蛻膜組織中S100A11表達(dá)；分析不同妊娠結(jié)局的管性不育施IVF-ET治療的病人中S100A11表達(dá)水平；分析不明原因不育

6、患者子宮內(nèi)膜中S100A11表達(dá)水平。
　　 方法：用免疫組化法檢測S100A11在子宮內(nèi)膜的定位，用Westernblotting法半定量檢測S100A11的表達(dá)水平，用qRT-PCR法檢測S100A11的表達(dá)水平mRNA。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，S100A11主要定位于子宮內(nèi)膜細(xì)胞的腺上皮和腔上皮，間質(zhì)細(xì)胞上有弱表達(dá)。
　　 2.免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示，在難免流產(chǎn)患者蛻膜組織中

7、，S100A11表達(dá)較弱。
　　 3.不明原因不育患者內(nèi)膜組織中S100A11mRNA的水平低于對照組，其中有3例患者明顯S100A11mRNA水平明顯低于平均值。
　　 4.管性不孕的婦女接受IVF-ET治療后治療失敗組(failedpregnancy，23例)的中分泌期子官內(nèi)膜中S100A11蛋白的表達(dá)明顯水平低于治療成功組(successfulpregnancy，15例)的婦女(P<0.05)。
　　 結(jié)論

8、：S100A11表達(dá)于人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中。在難免流產(chǎn)患者的蛻膜、不明原因患者的分泌中期內(nèi)膜中，S100A11均呈現(xiàn)低水平，在接受IVF-ET治療后妊娠失敗的患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，S100A11的表達(dá)較低，這些臨床資料均有力地暗示了S100A11在胚胎著床中發(fā)揮重要作用
　　 第二部分S100A11對胚胎種植的調(diào)控作用研究
　　 目的：應(yīng)用體外粘附模型和在體siRNA干擾的動物模型來進(jìn)一步驗(yàn)證S100A11是否參與對胚胎粘

9、附和著床的調(diào)控，并利用siRNA體外干擾技術(shù)，觀察S100A11對子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志性因子及免疫耐受相關(guān)細(xì)胞因子的直接調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 1.建立靶向性siRNA干擾的在體小鼠胚胎種植模型，以特異性S100A11siRNA干擾受孕小鼠子宮內(nèi)膜S100A11蛋白的表達(dá)，觀察S100A11對胚胎種植結(jié)局的影響。
　　 2.以JAr和Ishikawa細(xì)胞構(gòu)建體外粘附模型，通過siRNA干擾子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S1

10、00A11表達(dá)觀察滋養(yǎng)細(xì)胞球粘附率的變化，評價(jià)S100A11在滋養(yǎng)細(xì)胞球粘附到子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的作用。
　　 3.利用子宮內(nèi)膜Ishikawa細(xì)胞為體外模型，以特異性S100A11siRNA干擾內(nèi)膜細(xì)胞中S100A11的表達(dá)，qRT-PCR和Westernblotting檢測內(nèi)膜容受相關(guān)因子(LIF、integrinβ3、claudin-4和DKK-1等)及免疫耐受相關(guān)細(xì)胞因子的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.在體

11、的動物胚胎種植模型顯示，子宮內(nèi)膜中S100A11表達(dá)被敲減之后，胚胎著床率顯著性地低于對照組(p<0.05)。
　　 2.體外粘附模型中，與對照組相比，S100A11靶向性siRNA組的滋養(yǎng)細(xì)胞球粘附率顯著降低。
　　 3.子宮內(nèi)膜Ishikawa細(xì)胞中，在S100A11蛋白表達(dá)明顯降低的情況下，LIF，Integrinβ3，EGFR，claudin4和olfactomedin等重要內(nèi)膜容受相關(guān)因子的表達(dá)水平發(fā)生顯著性變

12、化，胚胎著床時調(diào)控母胎免疫耐受的重要細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生顯著性改變。
　　 結(jié)論：子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S100A11能夠直接調(diào)節(jié)胚胎種植時重要的內(nèi)膜容受相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響胚胎粘附、著床。
　　 第三部分S100A11調(diào)控胚胎著床的分子機(jī)制研究
　　 目的：S100A11調(diào)控胚胎著床的信號調(diào)節(jié)機(jī)制
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用Westernblotting和qRT-PCR法檢測雌激素(E2)、孕激素(P

13、4)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)以及表皮生長因子(EGF)對子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S100A11是否存在直接調(diào)控作用。
　　 2.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡及免疫電鏡方法對子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S100A11進(jìn)行亞細(xì)胞定位。
　　 3.應(yīng)用顯微熒光測定法聯(lián)合S100A11靶向性siRNA干擾技術(shù)檢測子宮內(nèi)膜細(xì)胞中Ca2+的濃度變化和S100A11、EGF之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S100A11的表達(dá)

14、不受E2，P4以及hCG的調(diào)控，但是，EGF的刺激能夠顯著性上調(diào)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S100A11的表達(dá)。
　　 2.激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，大量S100A11分布在PDIA3(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物)區(qū)域，通過免疫電鏡的方法同樣發(fā)現(xiàn)，S100A11在內(nèi)膜細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域有分布。
　　 3.鈣離子檢測結(jié)果顯示，EGF促進(jìn)了ATP引起的胞內(nèi)鈣離子的釋放，但細(xì)胞中S100A11被敲減后，這個作用被抑制。
　　 4.EGF促進(jìn)了

15、由thapsigargin和Ryanodine引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣庫的鈣離子釋放，但是，如果細(xì)胞胞內(nèi)S100A11被特異性S100A11siRNA干擾后，該現(xiàn)象受到抑制。
　　 結(jié)論：胚胎著床時，子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的S100A11能夠應(yīng)答內(nèi)源或外源性的EGF的刺激，顯著性上調(diào)。S100A11能夠促進(jìn)EGF刺激引起的胞內(nèi)鈣離子的升高。定位于細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域的S100A11可能參與了調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池中鈣離子的釋放和攝取，從而使內(nèi)膜細(xì)胞維持在一