小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜胚胎著床點及其旁組織microRNA差異表達及功能.pdf

1、目的:
　　子宮內(nèi)膜在著床窗期發(fā)生一系列變化以適應(yīng)胚胎植入，而胚胎的成功植入有賴于胚胎著床點與著床旁的基因表達差異。microRNA(miRNA)作為基因表達調(diào)節(jié)器，已被證實在小鼠胚胎著床點與著床旁存在差異表達，參與胚胎著床的調(diào)控。為更好的了解miRNA對胚胎著床的調(diào)控作用及其機制，應(yīng)用microRNA芯片和基因芯片對小鼠著床窗口期（孕5天）子宮內(nèi)膜著床點及其旁組織差異表達的miRNAs和mRNAs進行篩選，通過聯(lián)合分析芯片數(shù)據(jù)，

2、獲得著床點表達差異的信號通路，進而找到起重要作用的關(guān)鍵miRNAs，為探討小鼠胚胎著床的分子機制打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.標(biāo)本收集:收集小鼠孕5天子宮內(nèi)膜著床點和著床旁組織。
　　2.microRNA芯片分析:Trizol法提取樣本總RNA，將RNA用miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat＃208032-A,Exiqon,Denmark)按說明書操作步驟進行標(biāo)記。標(biāo)記后的RN

3、A在miRCURYTMArray(Exiqon，Denmark)進行雜交反應(yīng)。用Axon GenePix4000B芯片掃描儀進行圖像掃描，GenePix pro V6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　3.基因芯片分析:Trizol法提取樣本總RNA，用Quick AmpLabeling Kit(Agilent)標(biāo)記，利用Agilent Gene Expression HybridizationKit(Agilent)進行雜交，經(jīng)Gene

4、 Expression Wash Buffer(Agilent)洗滌后通過芯片掃描儀(Agilent)掃描圖像，最后利用Agilent Feature Extraction軟件分析數(shù)據(jù)。
　　4.熒光定量PCR驗證:依照miRNA成熟序列設(shè)計對應(yīng)的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR上下游引物，采用U6作為內(nèi)參，進行熒光定量PCR驗證;隨機選取基因芯片數(shù)據(jù)中部分基因，進行熒光定量PCR驗證。
　　5.生物信息學(xué)分析:運用miRNA靶基因

5、預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan、Pictar、miRBase檢索差異表達的miRNAs靶基因，再將所得靶基因與基因芯片數(shù)據(jù)進行比對，與差異表達的基因求交集得到在小鼠孕5天子宮內(nèi)膜中的潛在靶基因。利用數(shù)據(jù)庫GO和KEGG對所得靶基因進行功能分析，并進行負(fù)相關(guān)運算繪制負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而得到關(guān)鍵miRNAs。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯片顯示:與著床旁相比，在著床點上調(diào)超過2倍及以上的miRNAs有30個，下調(diào)超過2倍及以上的

6、有42個。
　　2.熒光定量PCR結(jié)果顯示:隨機選取的miRNAs和mRNAs表達趨勢與芯片數(shù)據(jù)一致。
　　3.生物信息學(xué)分析:通過將Targetscan、Pictar、miRGen數(shù)據(jù)庫所得預(yù)測靶基因與基因芯片所得差異基因求交集得到差異表達miRNAs在子宮內(nèi)膜的潛在靶基因;將這些靶基因進行功能分析得到著床點有20個信號通路上調(diào)、14個信號通路下調(diào);通過負(fù)相關(guān)運算得到負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，進而篩選出關(guān)鍵miRNAs。
　　結(jié)

7、論:
　　1.芯片結(jié)果證實小鼠孕5天子宮內(nèi)膜著床點和著床旁組織存在差異表達的miRNAs(如上調(diào)的miR-21、miR-96、miR-30b，下調(diào)的miR-298)，提示miRNAs在胚胎著床過程中起一定的調(diào)控作用。
　　2.利用熒光定量PCR對部分差異表達的miRNAs和基因芯片數(shù)據(jù)中部分基因的表達進行檢測，證實芯片數(shù)據(jù)可靠。
　　3.經(jīng)生物信息學(xué)分析，得到差異表達的miRNAs的負(fù)相關(guān)靶基因和著床點上調(diào)的信號通路（