人子宮內(nèi)膜窗口期基因表達平臺的建立及特異基因的篩選.pdf

1、胚胎著床是哺乳動物獨有的涉及胚胎和母體子宮內(nèi)膜相互作用的生殖過程。此過程在時間和空間上都是高度有序的。哺乳動物的子宮內(nèi)膜只有在著床窗開放時，才能接受胚泡，最終完成著床。人類的子宮內(nèi)膜僅在月經(jīng)周期很短的一段時期可以接受胚胎著床。大量研究證實這一時期主要受激素調(diào)控，接受態(tài)子宮內(nèi)膜的形成是這一時期的一個重要事件。為了解著床窗口期事件包括接受態(tài)子宮內(nèi)膜形成及胚胎著床等過程中的分子機制的全貌并深入研究著床窗口期的分子調(diào)控機制，本研究采用抑制消減雜

2、交技術(shù)，將人著床窗口期和早泌期子宮內(nèi)膜組織cDNA互相消減，構(gòu)建了這兩個時期的雙向消減cDNA文庫，并對篩選出來的部分已知和未知基因進行了深入探索。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.為了構(gòu)建人子宮內(nèi)膜窗口期基因表達平臺，我們從最初的實驗材料選擇就嚴格把關(guān)。我們以同一位志愿者的不同時相的子宮內(nèi)膜作為自身對照，結(jié)合掃描電鏡觀察結(jié)果、B超檢測結(jié)果、HE染色結(jié)果和PR免疫組化染色結(jié)果從多方面驗證了材料的可靠性，為后續(xù)的分子生物學(xué)

3、實驗打下堅實的基礎(chǔ)。
　　 2.SMARTM PCR cDNA Synthesis技術(shù)和抑制性消減雜交技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建了人窗口期子宮內(nèi)膜和早泌期子宮內(nèi)膜雙向cDNA抑制消減文庫。
　　 3.在人窗口期子宮內(nèi)膜cDNA文庫(HWE)和人早泌期子宮內(nèi)膜cDNA文庫(HEW)911個PCR純化產(chǎn)物進行斑點雜交分析，有354個在人窗口期和早泌期子宮內(nèi)膜存在4倍以上表達差異，其中192個在窗口期差異表達，162個在早泌期差異表達

4、。對斑點雜交篩選出的354個克隆中的130個克隆進行測序，共產(chǎn)生了93個質(zhì)量滿意的ESTs，總測序成功率達到71.54％。
　　 4.通過在互聯(lián)網(wǎng)上的比對，在HWE文庫中已知基因、已知ESTs和全新ESTs分別為52.46％、40.98％和6.56％；在HEW文庫中分別為48.57％、48.57％和2.86％。
　　 5.對代表已知基因的ESTs按照功能分類，發(fā)現(xiàn)主要涉及細胞分裂/細胞凋亡、蛋白合成和分解、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、分子

5、伴侶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架、粘附分子幾類，并初步探討了人子宮內(nèi)膜圍著床過程中差異表達基因的作用和意義。
　　 6.通過序列比對發(fā)現(xiàn)在HWE文庫中編號為82G7的克隆序列與已知基因NID-1同源性很高，用原位雜交技術(shù)檢測在窗口期和早泌期人子宮內(nèi)膜的表達，結(jié)果顯示NID-1在窗口期子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細胞中高表達，在早泌期的子宮內(nèi)膜組織中表達很弱。根據(jù)文獻推測，NID-1基因的表達產(chǎn)物的作用可能在人類的胚胎發(fā)生、著床和蛻膜化反

6、應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　 7.將人子宮內(nèi)膜窗口期特異表達的克隆編號為82F4的EST序列進行RACE擴增獲得一個新的cDNA序列，命名為PPI-82-F4，登錄GenBank，獲得登錄號為EF063108。
　　 8.應(yīng)用Northern雜交技術(shù)檢測PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宮內(nèi)膜的表達，結(jié)果顯示PPI-82-F4在窗口期子宮內(nèi)膜的表達顯著高于早泌期。應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子

7、宮內(nèi)膜的表達，結(jié)果顯示PPI-82-F4在窗口期子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細胞和腺上皮細胞中高表達，在早泌期的子宮內(nèi)膜組織中表達很弱。
　　 綜上所述，我們采用抑制性消減雜交構(gòu)建了雙向人子宮內(nèi)膜窗口期消減早泌期cDNA文庫，在這兩個文庫中各有192和162個陽性差異的克隆，我們所得到的基因包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架幾類。母體子宮內(nèi)膜從排卵到著床的過程中發(fā)生劇烈的變化，在孕激素的調(diào)控下，為了使著床窗開放做了充分準備，有很多相關(guān)基因表