人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接及其蛋白在胚胎著床中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：人類的受精卵僅約一半能發(fā)育到妊娠20周后，而其中70-80％的失敗歸因于著床失敗。胚胎著床失敗是早期妊娠丟失的主要原因。盡管IVF-ET及其相關(guān)技術(shù)取得了很大進(jìn)展，胚胎著床仍是決定妊娠率的主要環(huán)節(jié)。然而人類對(duì)胚胎著床分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對(duì)其它生殖過程的認(rèn)識(shí)。IVF及其衍生技術(shù)中，促卵泡發(fā)育理論和藥物幾經(jīng)更新，然而對(duì)促進(jìn)胚胎著床、改善子宮內(nèi)膜容受性方面幾無良策。
　　 人類分泌中期的子官內(nèi)膜在雌孕激素以及各種生長(zhǎng)因子

2、、細(xì)胞因子、粘附分子組成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)精細(xì)調(diào)控下表現(xiàn)為對(duì)胚泡最大的容受性，這一時(shí)期也稱為胚泡著床窗口期。在這一時(shí)期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)上都經(jīng)歷了重大的改變以適應(yīng)胚泡的侵入。子宮內(nèi)膜上皮包括腔上皮和腺上皮，兩者都是由極性的單層立方上皮細(xì)胞構(gòu)成，但是兩者在胚胎著床窗口期形態(tài)和功能出現(xiàn)了不同的變化。容受期宮腔上皮出現(xiàn)細(xì)胞極性的下降：細(xì)胞高度下降，微絨毛消失，并由胞飲突取代，細(xì)胞表面電荷減少，細(xì)胞表面粘附分子分布由基側(cè)膜轉(zhuǎn)向頂側(cè)膜。容受期腺

3、上皮細(xì)胞則細(xì)胞高度增加，表現(xiàn)為最大的分泌活性和細(xì)胞極性。兩種細(xì)胞在胚胎著床中有不同的作用，宮腔上皮與胚泡發(fā)生接觸、粘附，子宮腺體的分泌為圍著床期以及早期妊娠的胚胎的發(fā)育提供“蛋白乳”的作用。
　　 緊密連接是上皮細(xì)胞最富特征性的結(jié)構(gòu)，也是上皮細(xì)胞屏障功能和維持細(xì)胞極性、調(diào)節(jié)細(xì)胞旁小分子物質(zhì)通透性的重要結(jié)構(gòu)，由多種穿膜蛋白組成。其中Occludin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TJ組成蛋白，其生物學(xué)作用表現(xiàn)為多樣性，除了調(diào)節(jié)緊密連接的屏障功能外

4、還可能參與細(xì)胞增生與分化。
　　 緊密連接及其蛋白組成在人容受期與非容受期子宮內(nèi)膜宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞是否發(fā)生了變化？緊密連接蛋白Occludin是否受到性激素的調(diào)節(jié)，是否參與了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能？這一系列問題至今尚未見報(bào)道，本課題針對(duì)上述問題進(jìn)行了研究和探索。
　　 第一部分：月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接形態(tài)學(xué)及其蛋白組成研究
　　 目的：檢測(cè)月經(jīng)周期人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)及其組成

5、蛋白Occludin、Zo-1、claudin-1，-2，-3，-4，-5的定位和定量表達(dá)
　　 方法：透射電鏡檢查人正常子宮內(nèi)膜宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)在月經(jīng)周期中的變化；免疫熒光和免疫印跡法檢測(cè)TJ組成蛋白Occludin、Zo-1、claudin-1、-2、-3、-4、-5在人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的定位與分布、表達(dá)量的周期性變化。
　　 結(jié)果：透射電鏡研究結(jié)果顯示人子宮內(nèi)膜宮腔上皮細(xì)胞緊密連接在分泌中

6、期比增生中晚期淺、寬；而子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中分泌中期緊密連接比增生中晚期深、復(fù)雜、更加多的分支。共聚焦免疫熒光顯微鏡檢查提示子宮內(nèi)膜宮腔上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin，Zo-1表達(dá)在增生中晚期信號(hào)明顯強(qiáng)于分泌中期，熒光定量統(tǒng)計(jì)分析兩者有顯著差異。子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞Occludin,Zo-1的表達(dá)趨勢(shì)與腔上皮細(xì)胞剛好相反，在分泌中期信號(hào)明顯強(qiáng)于增生中晚期，熒光定量統(tǒng)計(jì)分析兩者有顯著差異。所有檢測(cè)的緊密連接蛋白Occludin、Zo-

7、1、claudin-1、-2、-3、-4、-5均可在分泌中期的腺上皮細(xì)胞膜頂端表達(dá)；在增生中晚期腺上皮細(xì)胞claudin-2、5表達(dá)陰性，claudin-1、-3在側(cè)基底膜表達(dá)；Occludin、Zo-1除了在細(xì)胞頂端外還在胞漿、側(cè)基底膜不連續(xù)表達(dá)。子宮內(nèi)膜組織western blot分析在分泌中期Occludin、claudin-1，-3，-4蛋白表達(dá)為最高峰。
　　 結(jié)論：人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接及其組成蛋白在月經(jīng)周期呈周

8、期性變化。其中宮腔上皮細(xì)胞分泌中期緊密連接及其組成蛋白下調(diào)；腺上皮細(xì)胞緊密連接及其蛋白表達(dá)上調(diào)
　　 第二部分：子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接及其蛋白Occludin在胚泡粘附中的作用
　　 目的：明確子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接在子宮內(nèi)膜與滋養(yǎng)細(xì)胞粘附中的調(diào)節(jié)作用
　　 方法：用透射電鏡、蛋白免疫印跡法、免疫熒光化學(xué)法、跨膜上皮細(xì)胞電阻(TER)檢測(cè)非容受性子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HECI-A細(xì)胞和容受性子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞RL95

9、-2細(xì)胞在TJ形態(tài)、功能、TJ蛋白組成和分布的差異；利用子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株-滋養(yǎng)細(xì)胞球(JAR spheroids)粘附的胚胎著床模型檢測(cè)兩種子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞胚泡粘附率的差異；對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞球進(jìn)行活細(xì)胞熒光染料標(biāo)記，利用雙色免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)在HEC-1A細(xì)胞與滋養(yǎng)細(xì)胞球發(fā)生粘附處TJ蛋白Occludin表達(dá)的變化；觀察HECl-A細(xì)胞Occludin siRNA干擾后檢測(cè)TJ功能、胚泡粘附率的變化；檢測(cè)著床促進(jìn)因子白細(xì)胞介素β-1對(duì)

10、HEC-1A細(xì)胞TJ蛋白Occludin和胚泡粘附率的調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)果：透射電鏡顯示HEC-1A細(xì)胞具有極性，緊密連接位于細(xì)胞頂端，免疫熒光染色顯示TJ蛋白Occludin、Zo-1表達(dá)于細(xì)胞膜。RL95-2細(xì)胞無TJ結(jié)構(gòu)，Occludin、Zo-1表達(dá)于細(xì)胞漿。Westem blot結(jié)果顯示HEC-1A細(xì)胞Zo-1，Occludin蛋白表達(dá)顯著高于RL95-2細(xì)胞。而Claudin-4在HEC-1A細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，RL95-2

11、細(xì)胞中陰性表達(dá)。HEC-1A細(xì)胞TER為(163.0±23.0)Ω×cm2，RL95-2細(xì)胞TER為(92.3±11.0)Ω×cm2，兩者相比有顯著差異(P<0.001)。HEC-1A細(xì)胞與JAR spheroids粘附率顯著低于RL95-2細(xì)胞。在JAR細(xì)胞球粘附處，HEC-1A細(xì)胞Occludin呈現(xiàn)為不連續(xù)、點(diǎn)狀分布。對(duì)HEC-1A細(xì)胞的Occludin經(jīng)siRNA干擾后，細(xì)胞在TJ重裝過程中TER峰值下降。白細(xì)胞介素1-β下調(diào)H

12、ECI-A細(xì)胞Occludin表達(dá)，并上調(diào)HECl-A細(xì)胞胚泡粘附率。
　　 結(jié)論：非容受性子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HEC-1A存在功能性的緊密連接。HEC-1A細(xì)胞TJ蛋白Occludin下調(diào)后能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與胚泡的粘附；在JAR細(xì)胞球粘附處，HEC-1A細(xì)胞的緊密連接蛋白Occludin為不連續(xù)的點(diǎn)狀分布。本研究提示緊密連接蛋白Occludin下調(diào)參與子宮內(nèi)膜容受性的建立。
　　 第三部分：Occludin表達(dá)的性

13、激素調(diào)控及其在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增生和分泌中的作用
　　 目的：明確子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Occludin表達(dá)的性激素調(diào)控；闡明Occludin在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增生和分泌中的作用。
　　 方法：雌激素、雌孕激素聯(lián)合培養(yǎng)增生期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞。Westem blot檢測(cè)上皮細(xì)胞Occludin、Claudin-4的表達(dá)。以IK細(xì)胞為腺上皮細(xì)胞模型，對(duì)其Occludin進(jìn)行siRNA基因干擾，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)

14、劑H2O2的敏感性，通過細(xì)胞周期檢測(cè)細(xì)胞的增殖率；并采用蒽酮法檢測(cè)細(xì)胞糖原含量的變化。
　　 結(jié)果：孕激素上調(diào)65kD Occludin、Claudin-4表達(dá)；對(duì)IK細(xì)胞Occludin基因干擾后，細(xì)胞凋亡敏感性下降；細(xì)胞增殖率增加；糖原分泌下降。
　　 結(jié)論：孕激素上調(diào)TJ蛋白65kD Occludin、Claudin-4表達(dá)，提示孕激素能增強(qiáng)TJ功能。Occludin能夠抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增生，并促進(jìn)其分泌。提