子宮內(nèi)膜缺血在腹腔子宮內(nèi)膜異位病灶形成中作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分正常非缺血內(nèi)膜建立小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型
　　目的：改良“同種異體腹腔注射正常非缺血子宮內(nèi)膜”建立小鼠子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis, EM)模型,研究影響建模的因素,探討內(nèi)膜數(shù)量及注射頻次對內(nèi)膜腹腔種植的影響。
　　方法：以8-10周齡的雌性C57BL/6近交系小鼠為模型鼠,對―同種異體腹腔注射內(nèi)膜法‖進(jìn)行如下改良:取供體鼠正常子宮內(nèi)膜均勻切成1×1mm大小,將組

2、織塊裝入20號針頭后進(jìn)行腹腔注射。研究內(nèi)容:(1)內(nèi)膜數(shù)量對內(nèi)膜腹腔種植影響:根據(jù)腹腔注射內(nèi)膜數(shù)量,建模鼠隨機(jī)分為6組(n=10):1片組,2片組,4片組,8片組,16片組,32片組。(2)根據(jù)內(nèi)膜注射次數(shù)對內(nèi)膜種植影響:以1片內(nèi)膜作為單次注射量,注射間期為5天,根據(jù)注射次數(shù)分為5組(n=10):1次組,2次組,3次組,4次組,5次組。建模后第7天觀察病灶,取病灶作HE染色組織學(xué)檢查。根據(jù)肉眼見典型病灶結(jié)合組織學(xué)檢查內(nèi)膜腺體為存活病灶。

3、以成模率及內(nèi)膜存活率作為評價(jià)內(nèi)膜存活情況指標(biāo)。成模率=建模成功鼠(只)/各組總建模鼠;內(nèi)膜存活率=存活內(nèi)膜總數(shù)(片)/腹腔注射內(nèi)膜總數(shù)(片)。
　　結(jié)果：改良后“腹腔注射內(nèi)膜法”建立EM模型具有以下優(yōu)點(diǎn):改良后內(nèi)膜殘留減少,異位病灶大小均勻,病灶分散,便于觀察,成模率、內(nèi)膜存活率穩(wěn)定。
　　(1)內(nèi)膜數(shù)量對內(nèi)膜腹腔種植影響:成模率隨著注射內(nèi)膜量增加而逐漸增加,從1片組20％(2/10)增加到8片組60％(6/10),當(dāng)內(nèi)膜數(shù)

4、量到達(dá)16片以上時(shí)成模率達(dá)到100％(10/10);Pearson相關(guān)分析內(nèi)膜數(shù)量與成模率成正相關(guān)(R=0.982),呈二次函數(shù)曲線:Y=1.095+0.863x-0.18x2(R2=0.944,F=33.45,p=0.003);內(nèi)膜種植數(shù)量與內(nèi)膜存活率相關(guān)(R=0.947),曲線擬合成二次函數(shù)曲線:Y=-1.167+3.72x-0.61x2(R2=0.972,F=69.127,p=0.001)?？ǚ綑z驗(yàn)8片組內(nèi)膜存活率顯著高于其它各組

5、(p<0.05)。
　　(2)內(nèi)膜注射次數(shù)對內(nèi)膜腹腔種植的影響:隨著內(nèi)膜注射次數(shù)增加,成模率逐漸增加,由1次組20％(2/10)增至5次組100％(10/10),Pearson相關(guān)分析內(nèi)膜注射次數(shù)與成模率正相關(guān)(R=0.981),回歸分析成二次函數(shù)曲線:Y=1.095+0.863x-0.18x2(R2=0.944,F=33.45,p=0.003);內(nèi)膜存活率與注射次數(shù)正相關(guān)(R=0.981),曲線擬合成冪函數(shù)曲線:Y=1.99X0

6、.949(R2=0.962,F=88.357,p=0.011)。
　　結(jié)論：改良后“同種異體腹腔注射非缺血內(nèi)膜”建立EM模型,病灶分散、病灶大小、數(shù)量、成模率、內(nèi)膜存活率變異小,模型穩(wěn)定,重復(fù)性好。內(nèi)膜數(shù)量及內(nèi)膜注射頻次是影響建模的重要因素。大量內(nèi)膜(大于16片)單次注射以及少量正常內(nèi)膜(1片)多次注射成模率高達(dá)100％,表明正常非缺血內(nèi)膜易于在腹膜種植存活。8片單次腹腔注射成模率“60％”,內(nèi)膜存活率“40％”,病灶數(shù)3-5個(gè),

7、適于進(jìn)行各種干預(yù)試驗(yàn),是理想的EM建模方案。
　　第二部分缺血內(nèi)膜腹腔種植探討
　　目的：月經(jīng)期螺旋動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮導(dǎo)致子宮內(nèi)膜嚴(yán)重缺血達(dá)4-48h,少許缺血內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流入盆腹腔,逆流內(nèi)膜的轉(zhuǎn)歸決定了是否發(fā)生內(nèi)異癥。但由于倫理學(xué)原因,逆流內(nèi)膜進(jìn)入腹腔后的動(dòng)態(tài)變化過程及轉(zhuǎn)歸目前仍不清楚。本研究以雌性C57BL/6小鼠為試驗(yàn)載體,觀察不同程度缺血子宮內(nèi)膜進(jìn)入腹腔后的動(dòng)態(tài)變化及最終轉(zhuǎn)歸。
　　方法：結(jié)扎供體鼠子宮弓形血管宮體端

8、及卵巢端的方法阻斷子宮血流,組織微氧測定儀精確測定子宮組織氧濃度已保證血管結(jié)扎可靠性。根據(jù)缺血時(shí)間(Hour)供體鼠隨機(jī)分為6組:0h組、0.5h組、1h組、2h組、4h組、8h組。根據(jù)“改良腹腔注射內(nèi)膜法”,采用8片單次注射方案進(jìn)行建模。對應(yīng)于供體鼠,180只建模鼠分為6組(n=30):0h組、0.5h組、1h組、2h組、4h組、8h組。建模后24h每組處死10只,觀察內(nèi)膜早期變化,留取標(biāo)本。建模后第7天處死剩余小鼠,觀察、測量異位病

9、灶,計(jì)算各組成模率及內(nèi)膜存活率。留取建模前供體鼠內(nèi)膜、建模后24h內(nèi)膜及異位病灶行HE染色組織學(xué)觀察,TUNEL染色測定細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：建模前內(nèi)膜細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)與缺血時(shí)間正相關(guān)(R=0.865,p=0.0029;建模后缺血時(shí)間與AI呈正相關(guān)(R=0.904,p=0.0048);建模后24h各組AI均較建模前升高(p<0.05)。Spearman相關(guān)分析成模率與缺血時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(R=-0.757,p=0.041);內(nèi)膜存

10、活率與缺血時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(R=-0.986,p=0.004)。
　　結(jié)論：內(nèi)膜損傷程度與缺血時(shí)間正相關(guān),嚴(yán)重缺血導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。缺血內(nèi)膜進(jìn)入腹腔后24h,內(nèi)膜損傷進(jìn)一步加重,細(xì)胞凋亡明顯增加。缺血降低內(nèi)膜在腹腔種植存活,嚴(yán)重缺血(>4h)內(nèi)膜進(jìn)入腹腔后,細(xì)胞因壞死或凋亡而清除,不能在腹膜種植形成異位病灶。
　　第三部分缺血預(yù)處理(IPC)在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用及機(jī)制
　　目的：組織器官經(jīng)過非致死性缺血后,能夠增強(qiáng)其

11、對隨后嚴(yán)重缺血耐受性即缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IPC)。前期研究證實(shí)當(dāng)內(nèi)膜缺血大于4h時(shí),內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)入腹腔后因凋亡而清除,不能在腹腔種植存活,這驗(yàn)證了正常婦女月經(jīng)期逆流內(nèi)膜的清除機(jī)制,但EM婦女逆流內(nèi)膜能抵抗缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,在腹膜種植存活。推測:內(nèi)異癥婦女子宮異常收縮導(dǎo)致子宮內(nèi)膜輕度缺血,產(chǎn)生IPC作用,保護(hù)內(nèi)膜缺血性損傷,減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)內(nèi)膜腹腔種植。本研究以C57BL/6小鼠為試驗(yàn)載體建立

12、小鼠子宮IPC模型,探討 IPC在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用,IPC對內(nèi)膜細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用以及IPC是否通過Akt信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。
　　方法：共分三部分內(nèi)容:(1)小鼠子宮IPC模型建立:卡前列素氨丁三醇(欣母沛)可誘導(dǎo)子宮收縮,導(dǎo)致子宮不同程度缺血。采用肌肉注射欣母沛 im qd×3d的方法建立小鼠子宮IPC模型。根據(jù)欣母沛劑量,供體鼠分為5組:A組為0.125 mg/kg體重, B組為0.25 mg/kg體重,C組為0.5

13、mg/kg體重,D組為1.0mg/kg體重。對照組E組肌注0.1ml注射用水。組織微氧儀動(dòng)態(tài)測定子宮組織氧濃度變化,測定各組子宮最低氧濃度,缺氧(氧濃度<100μ mol/l)持續(xù)時(shí)間。建模鼠對應(yīng)分為A、B、C、D、E共5組,每組20只。建模后第7天觀察病灶情況,計(jì)算各組成模率及內(nèi)膜存活率。
　　(2)IPC在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用:根據(jù)上述試驗(yàn),供體鼠以欣母沛0.5mg/kg體重,im,qd×3d作為IPC方案。第4天結(jié)扎子宮血

14、管建立子宮內(nèi)膜缺血模型(Ischemia,ISCH)。供體鼠根據(jù)IPC及缺血時(shí)間分為6組(n=30只):IPC組,ISCH2h(缺血2h), ISCH4h組(缺血4h),IPC+ISCH2h組,IPC+ISCH4h組,CON組(對照組)。采用改良腹腔內(nèi)膜注射法建立EM模型。受體鼠對應(yīng)分為IPC組,ISCH2h組,ISCH4h組, IPC+ISCH2h組,IPC+ISCH4h組,CON組。取建模前及建模后24h內(nèi)膜,行組織切片TUNEL染

15、色檢測細(xì)胞凋亡變化。建模后第7天觀察病灶,計(jì)算各組建模率及內(nèi)膜存活率。
　　(3)IPC保護(hù)作用的分子機(jī)制本部分選擇欣母沛0.5mg/kg體重,im,qd×3d作為IPC方案,結(jié)扎子宮血管2h作為子宮內(nèi)膜ISCH模型。Akt特異性阻斷劑LY294002(LY)進(jìn)行阻斷試驗(yàn),于注射欣母沛前15min,靜脈注射LY294002,劑量為10μmol/kg。根據(jù)IPC、ISCH及LY,32只鼠隨機(jī)分為4組(n=8只):CON組、ISCH組

16、、IPC+ISCH組、LY+IPC+ISCH組。子宮缺血2h取內(nèi)膜組織行TUNEL染色測細(xì)胞凋亡指數(shù),WEST檢測磷酸化Akt(p-Akt)及其下游底物磷酸化水平(p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6),以及活化caspase-3。
　　結(jié)果：(1)小鼠子宮IPC模型建立:Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)最低氧濃度與欣母沛劑量呈負(fù)相關(guān)(p=0.049,R=-0.88),缺氧持續(xù)時(shí)間與欣母沛劑量完全相關(guān)(p

17、=0.000,R=1.0)?？ǚ綑z驗(yàn)C組成模率及內(nèi)膜存活率高于A、B、D組及對照組(P<0.05)。
　　(2)IPC在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用:結(jié)果顯示IPC+ISCH2h組成模率及內(nèi)膜存活率高于ISCH2h組(p=0.028,p=0.000);IPC+ISCH4h組成模率及內(nèi)膜存活率高于ISCH4h組(p=0.035,p=0.024)。IPC+ISCH2h組AI低于ISCH2h組(p<0.05),IPC+ISCH4h組AI低于I

18、SCH4h組(p<0.05)。
　　(3)IPC保護(hù)作用的分子機(jī)制結(jié)果顯示IPC+ISCH組AI低于ISCH組及IPC+ISCH+LY組(p<0.05),ISCH組與IPC+ISCH+LY組AI無差別(p>0.05)。IPC+ISCH組p-Akt、p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6高于CON組及ISCH組(p<0.05);ISCH組p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S

19、6與LY+IPC+ISCH組相比無差別(p>0.05);IPC+ISCH組活化Caspase-3水平低于ISCH組及LY+IPC+ISCH(p>0.05),LY+IPC+ISCH組與ISCH組無差別(p>0.05)。
　　結(jié)論：欣母沛能有效誘導(dǎo)子宮收縮而缺血建立小鼠子宮IPC模型;IPC促進(jìn)正常非缺血內(nèi)膜腹腔種植;IPC減少缺血內(nèi)膜細(xì)胞凋亡,促進(jìn)缺血內(nèi)膜腹腔種植存活;IPC通過激活A(yù)kt信號通路,磷酸化其下游底物Bad、GSK-3