分枝桿菌噬菌體Chy2生物擴增法的建立及其檢測效果的評價.pdf

1、目的：
　　結(jié)核病是嚴重危害人類健康的公共傳染性疾病，具有高感染率、高患病率和高病死率的特點。早期發(fā)現(xiàn)、快速診斷結(jié)核病，從而及時給予有效的藥物治療是減少結(jié)核病傳播機會，控制疫情蔓延的重要手段。噬菌體生物擴增法是用分枝桿菌噬菌體D29快速檢測結(jié)核分枝桿菌活菌建立的病原學(xué)表型檢測技術(shù)。該方法成本低、操作簡易、檢測特異性高、48小時即可報告結(jié)果，具有廣闊的開發(fā)空間和巨大的應(yīng)用潛能，尤其適合在結(jié)核病高負擔、經(jīng)濟水平相對滯后的發(fā)展中國家和地

2、區(qū)推廣使用。然而，噬菌體生物擴增法最大的缺陷是檢測靈敏度低，成為遏制該技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸。
　　本課題組在國家“十一五”重大科技專項課題的前期研究中，自我院結(jié)核病房的花盆泥土發(fā)現(xiàn)1株分枝桿菌噬菌體，經(jīng)分離、純化，對其生物學(xué)特性、遺傳背景、全基因組序列進行全面分析，證明是一種新結(jié)核分枝桿菌噬菌體，命名為Chy2。本研究針對噬菌體生物擴增法的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，探索Chy2應(yīng)用于生物擴增法的技術(shù)條件，擬建立噬菌體Chy2生物擴增法（Chy2

3、-PhaB）;初步探討Chy2-PhaB對結(jié)核分枝桿菌的檢測效果，為進一步發(fā)掘噬菌體Chy2的臨床應(yīng)用價值，優(yōu)化噬菌體生物擴增法檢測技術(shù)、提升其檢測效能提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、液體培養(yǎng)法培養(yǎng)恥垢分枝桿菌，羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌標準株，菌落計數(shù)法測定細菌濃度，雙層平板培養(yǎng)法擴增噬菌體，小平板法測定噬菌體滴度。
　　2、噬菌斑點測法觀察噬菌體殺滅劑滅活噬菌體Chy2的最低濃度和最短時間，確定其作用時間和

4、工作濃度。
　　3、噬菌斑計數(shù)法確定Chy2與結(jié)核分枝桿菌孵育達到最高感染率的感染時間和感染滴度。
　　4、收集并處理58份臨床痰液標本，分別用噬菌體Chy2和D29生物擴增法檢測痰液標本中的結(jié)核分枝桿菌，同時以改良羅氏培養(yǎng)法作診斷標準，對比評價兩種噬菌體生物擴增法的檢測效能。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)培養(yǎng)后，恥垢分枝桿菌濃度為4.5×109CFU/ml，結(jié)核分枝桿菌濃度為3×108 CFU/ml;經(jīng)擴增后，Chy

5、2滴度為2.2×1011PFU/ml，D29滴度為1.9×1011PFU/ml。
　　2、最低6％硫酸亞鐵銨溶液與Chy2作用最短5min可徹底滅活宿主菌體外的游離Chy2。
　　3、Chy2滴度為2.2×1011CFU/mL，與結(jié)核分枝桿菌孵育240min，感染效率最高。
　　4、Chy2-PhaB對痰標本中結(jié)核分枝桿菌的檢測靈敏度、特異性、Youden指數(shù)、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為94.7％、85.0％、0.7