恥垢分枝桿菌對(duì)SWU1噬菌體耐受機(jī)制的初探及其MSMEG_3705基因功能研究.pdf

1、噬菌體是一種細(xì)菌病毒，其數(shù)量達(dá)到1030之多，它是目前生物圈中存在數(shù)量最多的一類微生物，也是一類寶貴的生物資源。噬菌體在治療細(xì)菌感染、耐藥病原菌的快速檢測(cè)、細(xì)菌分型、食品中細(xì)菌的控制、治理環(huán)境污染、控制病原菌傳播以及分子生物學(xué)研究等方面是一個(gè)非常有潛力的工具。尤其在臨床上，目前的結(jié)核分枝桿菌常規(guī)檢查耗時(shí)長(zhǎng)，而利用分枝桿菌噬菌體開發(fā)出來的新型檢測(cè)試劑盒卻大大縮短了結(jié)核病的診斷時(shí)間，為病人贏得了寶貴的治療時(shí)間。但是，近年來病原菌對(duì)噬菌體耐受

2、現(xiàn)象逐漸顯現(xiàn)，這給原本前途一片光明的噬菌體治療和診斷蒙上了一層陰影。本研究想利用恥垢分枝桿菌作為模式菌株，探究結(jié)核分枝桿菌對(duì)于噬菌體的耐受機(jī)制，得到了如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　我們利用裂解性分枝桿菌噬菌體TM4作為篩選條件，成功篩選到了對(duì)TM4和SWU1噬菌體耐受的恥垢分枝桿菌Tn5轉(zhuǎn)座子突變株，根據(jù)其在突變庫中的位置命名為M12。通過將SWU1的基因組電轉(zhuǎn)入M12突變株，發(fā)現(xiàn)在噬菌體培養(yǎng)雙層平板上能夠看見渾濁的噬菌斑，這表明M12對(duì)噬

3、菌體SWU1的耐受發(fā)生在噬菌體吸附或者DNA注入這一步。接下來，通過透射電鏡觀察M12突變株對(duì)SWU1噬菌體的吸附情況，證實(shí)M12轉(zhuǎn)座子突變株抑制了SWU1噬菌體的吸附。我們還分析了M12突變株的單菌落形態(tài)，M12與野生型恥垢分枝桿菌相比，單菌落形態(tài)差異比較明顯，主要表現(xiàn)為菌落表面光滑、有光澤、邊緣整齊、無褶皺，而野生型恥垢分枝桿菌單菌落形態(tài)表現(xiàn)為邊緣不整齊、表面無光澤、且有褶皺。這進(jìn)一步提示或許由于M12細(xì)胞壁成分的改變而引起單菌落形

4、態(tài)的改變，并且使得M12阻止SWU1噬菌體吸附，從而顯示出宿主對(duì)噬菌體的耐受表型。于是，我們接下來通過進(jìn)一步檢測(cè)M12和野生型恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁脂肪酸成分，發(fā)現(xiàn)M12與野生菌株相比，脂肪酸成分雖然沒有顯著差異，但各成分之間含量差異較大。之后，利用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)的方法，成功鑒定了M12突變株中Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)位于恥垢分枝桿菌基因組上MSMEG_3705基因中。緊接著，通過Xer-cise系統(tǒng)，我們構(gòu)建了MSME

5、G_3705敲除菌株，利用PCR的方法，在MSMEG_3705上下游250bp處設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物送BGI測(cè)序，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證成功構(gòu)建了MSMEG_3705全基因敲除菌株。通過檢測(cè)了MSMEG_3705敲除菌株對(duì)SWU1的敏感性，發(fā)現(xiàn)MSMEG_3705敲除菌株沒有恢復(fù)M12轉(zhuǎn)座子突變株對(duì)噬菌體耐受的表型。據(jù)此，初步得出結(jié)論，M12轉(zhuǎn)座子突變株的噬菌體耐受表型，與Tn5插入到MSMEG_3705基因上導(dǎo)致該基因功能的喪失無直接的聯(lián)

6、系。推測(cè)M12耐受TM4、SWU1的機(jī)理可能是因?yàn)镸12自發(fā)突變，導(dǎo)致宿主上噬菌體受體的缺失或者改變而形成耐受表型。
　　另一方面，拿到MSMEG_3705敲除菌株后，進(jìn)一步分析了MSMEG_3705基因的功能。通過對(duì)MSMEG_3705蛋白序列的BLAST比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MSMEG_3705蛋白同源性較高的7個(gè)分枝桿菌假定蛋白都屬于主要輔助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。進(jìn)一步通過跨膜結(jié)構(gòu)域和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析MSMEG_3705編碼蛋白，結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)該蛋白具有該家族典型的12個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，且三維結(jié)構(gòu)成圓桶狀，這與已經(jīng)進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析的主要輔助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(MFS)蛋白相一致。生物信息學(xué)分析證實(shí)了MSMEG_3705的確屬于MFS蛋白家族。我們測(cè)定了MSMEG_3705突變株對(duì)10種常見分枝桿菌抗生素和5種金屬離子的最低抑菌濃度(MIC)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果指明MSMEG_3705敲除菌株對(duì)對(duì)卷曲霉素敏感性提高2倍，但對(duì)利福平表現(xiàn)出耐受，其MIC是野生型的2倍。M12對(duì)其他大部分抗

8、生素MIC相較于野生型對(duì)照無顯著變化，這指明MSMEG_3705基因在恥垢分枝桿菌外排卷曲霉素中發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)野生菌株和缺失菌株胞內(nèi)溴化乙錠的積累分析，發(fā)現(xiàn)MSMEG_3705基因編碼的外排泵蛋白在恥垢分枝桿菌外排EB過程中也扮演著重要角色。
　　在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)MSME_3705敲除菌株比野生型恥垢分枝桿菌在同樣條件下提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，RT-PCR結(jié)果指明MSMEG_3705基因敲除影響了下游基因MSMEG_37