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1、結(jié)核病是目前單因素引起發(fā)病率和死亡率最高的疾病。全球有三分之一的人群感染結(jié)核分枝桿菌,每年新增800萬結(jié)核病人,有200萬人死于結(jié)核病。世界衛(wèi)生組織于1993年宣布:全球處于結(jié)核病緊急狀態(tài)。引起結(jié)核病再次大流行的原因之一是不合理用藥導(dǎo)致的耐藥菌株的出現(xiàn)。為有效執(zhí)行DOTS(DirectlyObservedTreatment,Short-Course)策略,快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和正確選擇抗生素治療成為防治結(jié)核病的關(guān)鍵。
利用串聯(lián)
2、式壓電石英傳感器對(duì)環(huán)境電參數(shù)響應(yīng)靈敏的特點(diǎn),將其應(yīng)用于微生物生長(zhǎng)狀態(tài)監(jiān)測(cè)中,及早得到微生物的生長(zhǎng)信息。用串聯(lián)式壓電傳感器,分析培養(yǎng)基不同成分對(duì)微生物生長(zhǎng)壓電信號(hào)的影響;用單因素分析方法,分析不同成分對(duì)恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)曲線的影響。將M7H9培養(yǎng)基中成分的作用分為緩沖作用、合成代謝作用、生長(zhǎng)促進(jìn)因子作用,構(gòu)建分枝桿菌壓電檢測(cè)體系。對(duì)壓電頻移曲線進(jìn)行分類,將壓電頻移信號(hào)產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)分為分解代謝所分泌電導(dǎo)成分和合成代謝所吸收電導(dǎo)
3、成分兩種類型,分別產(chǎn)生向下的頻移曲線和向上的頻移曲線,提升對(duì)串聯(lián)式壓電微生物傳感器頻移信號(hào)的理論認(rèn)識(shí)。
用噬菌體成斑率為指標(biāo),研究噬菌體在環(huán)境中穩(wěn)定的條件,保證噬菌體的感染效率;研究噬菌體最佳的滅活方法,減少實(shí)驗(yàn)過程出現(xiàn)假陽(yáng)性。分析鈣鎂濃度對(duì)噬菌體吸附、頓挫感染的影響,得出最佳的鈣離子濃度、殺毒劑硫酸亞鐵胺濃度。用一步生長(zhǎng)曲線研究噬菌體D29與恥垢分枝桿菌作用的特性,分析影響噬菌體生物放大作用的外部環(huán)境因素,優(yōu)化出最適合結(jié)核分
4、枝桿菌快速檢測(cè)的培養(yǎng)基配方。綜合考慮噬菌體的穩(wěn)定條件、滅活條件、一步生長(zhǎng)曲線的最優(yōu)條件和恥垢分枝桿菌在M7H9培養(yǎng)基中壓電信號(hào)的影響因素,選擇適合構(gòu)建噬菌體生物放大的壓電傳感器檢測(cè)培養(yǎng)體系。
結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌能被噬菌體D29感染,保護(hù)菌體內(nèi)的噬菌體D29不被硫酸亞鐵殺滅。樣品中的結(jié)核分枝桿菌被作為載體,將加在樣品處理液中的噬菌體D29轉(zhuǎn)移到檢測(cè)池。在檢測(cè)池中,噬菌體D29裂解結(jié)核分枝桿菌釋放子代噬菌體,子代噬菌體感染
5、恥垢分枝桿菌,經(jīng)歷快速的感染、復(fù)制、裂解的循環(huán)過程。這個(gè)循環(huán)過程構(gòu)成噬菌體鏈?zhǔn)缴锓糯蠓磻?yīng),最終得到完全抑制恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)的結(jié)果。樣品中結(jié)核分枝桿菌的濃度不同,轉(zhuǎn)移到檢測(cè)池中的噬菌體D29的也濃度不同,完全抑制恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)所需的循環(huán)次數(shù)不同,最終導(dǎo)致檢測(cè)池中恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)程度不同。當(dāng)樣品中沒有結(jié)核分枝桿菌充當(dāng)噬菌體的載體時(shí),則無噬菌體被轉(zhuǎn)移到檢測(cè)池中,恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)不受噬菌體抑制。恥垢分枝桿菌在生長(zhǎng)過程中,利用培養(yǎng)基中的電導(dǎo)
6、成分,引起壓電傳感器產(chǎn)生頻移響應(yīng)信號(hào)。不同濃度的結(jié)核分枝桿菌引起不同強(qiáng)度的壓電頻移響應(yīng)信號(hào)。
在液體培養(yǎng)基中,充分發(fā)揮噬菌體的鏈?zhǔn)椒糯笞饔?,提高檢測(cè)方法靈敏度。應(yīng)用壓電傳感器對(duì)電參數(shù)的靈敏響應(yīng),提高檢測(cè)方法的靈敏度。通過噬菌體D29橋梁作用,將慢速生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè),轉(zhuǎn)換成快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌的檢測(cè),大大提高檢測(cè)速度。噬菌體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的裂解作用,可降低實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn),安全可靠。恥垢分枝桿菌檢測(cè)所需要培養(yǎng)基和儀器要求低,成本
7、低廉。用數(shù)學(xué)模型分析檢出時(shí)間與溶液中噬菌體濃度的關(guān)系,得出檢測(cè)時(shí)間與溶液中1-102pfu/mL噬菌體D29濃度成線性的結(jié)果。用雙盲對(duì)照的原則研究樣本處理對(duì)檢測(cè)方法的影響,得出正確的樣本處理方法,保證結(jié)果的準(zhǔn)確度,避免假陽(yáng)性和假陰性。該方法可以檢測(cè)102cfu/mL的結(jié)核分枝桿菌,檢測(cè)時(shí)間縮短到30小時(shí),具有臨床診斷實(shí)用價(jià)值。噬菌體放大多通道壓電傳感器法(PA-MSPQC)與BactecMGIT960法的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較結(jié)果,得出兩者檢測(cè)臨床
8、樣本的靈敏度和特異度一致。但PA-MSPQC法檢測(cè)時(shí)間只需30小時(shí),優(yōu)于培養(yǎng)法。PA-MSPQC法還可以通過提高噬菌體感染效率,進(jìn)一步提高方法的靈敏度。
防止耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)是控制結(jié)核病的關(guān)鍵措施,實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌株耐藥的快速檢測(cè),對(duì)合理用藥和防止耐藥菌株的出現(xiàn)有非常重要的意義。我們根據(jù)噬菌體只能感染活的結(jié)核分枝桿菌的特點(diǎn),將PA-MSPQC法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)。建立PA-MSPQC法耐藥結(jié)果的頻移標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)實(shí)
9、驗(yàn)條件和比例法耐藥的判別標(biāo)準(zhǔn),對(duì)利福平、異煙肼和乙胺丁醇三種藥物,當(dāng)恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)引起的頻移小于121Hz時(shí),認(rèn)為菌株對(duì)藥物耐受;對(duì)鏈霉素藥物,當(dāng)恥垢分枝桿菌引起的壓電頻移小于92Hz時(shí),判定菌株對(duì)鏈霉素耐藥。將雙盲實(shí)驗(yàn)中,PA-MSPQC法所得的結(jié)果與MGIT960法所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,得出PA-MSPQC法與MGIT960法沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,能準(zhǔn)確檢測(cè)臨床結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素等一線抗結(jié)核藥物的耐受情
10、況。由于PA-MSPQC法能快速報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法用于臨床結(jié)核分枝桿菌菌株的耐藥實(shí)驗(yàn)。但是PA-MSPQC同樣存在噬菌體感染效率的問題,有可能將未感染噬菌體的結(jié)核分枝桿菌當(dāng)成耐藥菌株,影響方法的準(zhǔn)確度。因此,優(yōu)化培養(yǎng)基成分是提高檢測(cè)方法靈敏度,提高耐藥實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。
為建立微生物快速傳感檢測(cè)新方法,我們使用石墨烯新材料和核酸序列代替適配體進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)。用化學(xué)氣相沉積法在銅箔表面制備大面積石墨烯,用拉曼光譜分
11、析在不同氣體條件下形成石墨烯的質(zhì)量,研究氫氣流量、溫度、基底材料對(duì)石墨烯質(zhì)量的影響,直接制備出可用于電極分析的大面積單層石墨烯。用電化學(xué)阻抗譜和循環(huán)伏安法研究核酸序列在石墨烯電表面吸附和解離的條件,得出鈉的濃度在100mmol/L、鎂的濃度在5mmol/L,核酸序列通過p-p堆集作用而吸附,電極表面電子傳遞阻力增大;在鈣、鎂離子的存在條件下,吸附的核酸序列與互補(bǔ)序列作用解離,電極表面電子傳遞阻力減小;電極表面的電子傳遞阻力的擬合分析得出
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