噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核分枝桿菌技術的引進與運用-自貢市疾病預防

1、核酸指紋圖譜分析應用于分枝桿菌菌種鑒定,自貢市疾病預防控制中心 鄧建平 2017.04,前言,分枝桿菌屬包括結(jié)核分枝桿菌復合群(MTC,包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、卡介苗)、麻風分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)。自1882年Koch發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌以來，已報道了100余種分枝桿菌，其中約30種與人類或動物疾病有關。其中結(jié)核分枝桿

2、菌(MTB)是最常見且是最重要的致病菌。不同分枝桿菌感染的癥狀、體征及影像學檢查并無特異性，而各自的治療方案卻差異較大。為對結(jié)核病病原做出準確判定，以及在亞種水平上對我市分枝桿菌臨床分離株復合群進行菌種鑒定，是結(jié)核病防治工作中，病原學診斷的一項重要指標。,一、結(jié)核病的流行疫情,結(jié)核病是伴隨人類歷史最長，由單一致病菌造成人類死亡最多的慢性傳染病，歷史上稱其為“白色瘟疫”，我國舊稱“癆病”，民間素有“十癆九死”的之說。在20世紀40年代鏈霉

3、素等抗結(jié)核藥物發(fā)明之前，結(jié)核病幾乎是不治之癥。 根據(jù)WHO統(tǒng)計,全球結(jié)核病感染人數(shù)約20億,每年新發(fā)病例800萬,每年死于結(jié)核的人數(shù)約130萬。我國是世界上22個結(jié)核病高負擔國家之一，患者人數(shù)僅次于印度、印尼，居全球第三位。,3,,WHO發(fā)布2016年全球結(jié)核病報告,2016年10月14日 發(fā)布，數(shù)據(jù)涵蓋了202個國家和地區(qū)的99%的人口和結(jié)核病病例。 2015年，世界范圍內(nèi)估計有1040萬新發(fā)病例，其中

4、男性590萬（56%），女性350萬（34%），兒童100萬（34%）。新發(fā)病例中有120萬（11%）HIV患者。 印度、印度尼西亞、中國、尼日利亞、巴基斯坦和南非這六個國家占了新發(fā)病例總數(shù)的60%。 2015年全球估計有48萬新發(fā)的MDR-TB病例和10萬耐利福平結(jié)核?。≧R-TB）病例。印度、中國和俄羅斯三個國家占所有這58萬病例的45%。 2015年有140萬人死于結(jié)核病，另外40萬

5、是TB/HIV雙重感染人群死亡。雖然在2000到2015年間，結(jié)核病死亡以22%的速度在下降，但2015年結(jié)核病仍然排在全部死亡原因中的前十名。,WHO發(fā)布2016年全球結(jié)核病報告,全球在2000到2015年避免了4900萬結(jié)核病死亡。2015年全球報告肺結(jié)核病例610萬，仍有約430萬的估算病例未被發(fā)現(xiàn)和報告。在2015年估計的58萬MDR-TB患者中，只有12.5萬（20%）得到了治療。2013年MDR-TB病例隊列的治療成功率

6、為52%。2015年，55%的報告肺結(jié)核病例進行了HIV檢測，TB/HIV 雙重感染的病例中接受抗病毒治療的占78%。,結(jié)核病高負擔國家前三位,每年報告發(fā)病數(shù)仍居甲乙類傳染病的第二位西部地區(qū)疫情重主要以農(nóng)牧民為主老年人高發(fā),,我國仍是全球結(jié)核病高負擔國家之一2014年新發(fā)結(jié)核病患者93萬，位居全球第3位占全球患者數(shù)的9.7%,我國結(jié)核病疫情現(xiàn)狀,我國結(jié)核病疫情現(xiàn)狀,“六多”的特點 ：1、感染人數(shù)多。目前全國約有5．5億人感

7、染過結(jié)核菌，感染率達到44．5％，高于全球1／3的感染率水平。2、患病人數(shù)多。全國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核病人約450萬，患病人數(shù)居世界第二位。3、新發(fā)患者多。全國每年新發(fā)生肺結(jié)核患者約145萬。2004年，全國法定報告的甲、乙類傳染病中，肺結(jié)核的報告發(fā)病率位居首位。4、死亡人數(shù)多。全國每年約有13萬人死于結(jié)核病，是各種其他傳染病和寄生蟲病死亡人數(shù)總和的2倍。5、農(nóng)村患者多。全國約有80％的結(jié)核病患者集中在農(nóng)村，而且主要在中西部地區(qū)。

8、6、耐藥患者多。全國菌陽肺結(jié)核病人中耐藥病人約占1／4，而據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，全球每年新發(fā)生的耐藥結(jié)核病人中，有1／4在我國。一名涂陽肺結(jié)核患者若不加以治療，一年平均可感染10-15名易感者。,二 非結(jié)核分枝桿菌概況,非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM) ： 指除結(jié)核分枝桿菌復合群( 包括結(jié)核、牛、非洲和田鼠分枝桿菌) 和麻風分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌的總稱。非結(jié)核分支桿菌感染 ： 感

9、染了NTM, 但未發(fā)病。非結(jié)核分支桿菌病 ： 感染了NTM, 并引起相關組織、臟器的病變。,非結(jié)核分枝桿菌分離,全國 27 省全人群 NTM 感染率,感染率特點–?省間差異從1.9%～ 44.9%–?地理特征南方高于北方，沿海高于內(nèi)地–?氣溫溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū),分枝桿菌菌種鑒定的必要性,1.NTM病呈快速增長趨勢，已成為威脅人類健康的重要問題，1990：4.1% 2000：11.9% 2010：22.9%2.老年化現(xiàn)象：3

10、.診斷：影像學缺乏特異性、臨床癥狀不典型、可長期誤診為結(jié)核病4.治療：對常用的抗結(jié)核藥物天然耐藥治療效果不確切、治療費用較高及易引起不良反應,分枝桿菌菌種鑒定的現(xiàn)狀,目前診斷NTM的技術還十分滯后，最突出的是實驗室質(zhì)量控制較差，不同的鑒定方法可能產(chǎn)生不同的鑒定結(jié)果，導致分枝桿菌假陽性和假陰性升高。實驗室菌種鑒定水平不高，使得1/4的NTM病誤診為結(jié)核病。因此，在條件允許的情況下，對已明確的NTM菌株進行鑒定很重要，這有助于區(qū)分是否致病

11、菌，以進一步指導臨床處理。,分枝桿菌鑒定方法,基于生長特性和生化反應的傳統(tǒng)方法基于特定基因序列的分子分型方法(如核酸指紋圖譜分析,hsp65,rpoB基因多態(tài)性)根據(jù)菌體特定成份(如脂肪酸,分枝菌酸等)建立的色譜法 基于蛋白組學的飛行質(zhì)譜技術,三 核酸指紋圖譜法,核酸指紋圖譜分析是以分枝桿菌復合群各菌種的特異性基因片段（16SrRNA、Rv0577、IS1561’、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8、Rv3120，代號

12、為1、2、3、4、5、6、7）作為靶標，通過特異性基因片段的有無進行菌種鑒定。針對上述7個結(jié)核分枝桿菌復合群的特異基因，合成7對特異引物7，分別對分枝桿菌的7個基因進行擴增靶基因序列，產(chǎn)物電泳后獲得酶切指紋圖譜。,PCR定義,PCR反應特點,PCR反應基本步驟,PCR技術的基本原理,,,,,,,,,,,,,核酸指紋圖譜操作步驟,1、DNA的提取,（1）水煮法,（2）CTAB提取法,（3）柱子提取法,（4）全自動核酸提取法,水煮法提取DN

13、A,（1）收集菌體，用生理鹽水洗脫L-J培養(yǎng)基菌體；（2）離心收集菌體，400ul TE重新懸菌；（3）恒溫金屬浴98℃ 20分鐘，超聲波破碎 15分鐘；（4）13000rpm離心5分鐘；（5）取上清即為模板DNA。,全自動核酸提取儀提取DNA,2、PCR擴增,在25ul反應體系中，上、下引物各1ul,2×Taq PCR MasterMix 13ul，DNA模板4ul，純水6ul。PCR反應條件：預變性9

14、4℃5min ，變性94℃ 1min ， 退火60℃1mi n，延伸72℃1 min ，循環(huán)次數(shù)30次，最后充分延伸72℃10 min， 每次擴增分別設陽性及陰性對照 。,3、電泳產(chǎn)物分析,擴增產(chǎn)物 ，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果獲得核酸指紋圖譜 。,標準分枝桿菌核酸指紋圖譜,自貢市分枝桿菌指紋圖譜,自貢市分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果,2012至2016年共完成3650株菌株DNA提取及鑒定工作，以核酸為模板擴增7個位點（16S rR

15、NA，Rv0577，IS1561’，Rv1510，Rv1970，Rv3877/8和Rv3120）的目的片段，根據(jù)核酸指紋圖譜初步鑒定結(jié)核分枝桿菌1634株、非洲Ⅰ型20株、非結(jié)核分枝桿菌38株。,該技術的引進與應用對了解我市結(jié)核分枝桿菌流行株的種型特征，進行分子流行病學調(diào)查和研究，臨床診斷和治療提供了病原學依據(jù)，并取得可喜的成果。 使患者個體及時得到診治提供了保障，為控制結(jié)核病的傳播具有實際意義，同時推動了中心結(jié)核病實驗室檢測能力的建設