抗酸染色陽性痰涂片刮取物擴(kuò)增分枝桿菌基因的初步探索.pdf

1、背景：
　　結(jié)核病是危害全球健康的重大公共衛(wèi)生問題，雖隨著短程督導(dǎo)化療方案的普遍實(shí)施，結(jié)核病疫情已經(jīng)有所控制，但當(dāng)前結(jié)核病控制仍面臨著耐多藥，合并HIV感染及流動(dòng)人口等問題帶來的巨大挑戰(zhàn)。非結(jié)核分枝桿菌是指結(jié)核與麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌，是一類在自然界中廣為分布的環(huán)境病原體。其可通過多種途徑感染易感人群引起局部或全身病灶，甚至導(dǎo)致死亡。國(guó)內(nèi)外越來越多的研究表明非結(jié)核分枝桿菌感染及其相關(guān)疾病的流行已呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。
　

2、　抗酸染色涂片鏡檢法簡(jiǎn)單、快速，且是發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核傳染源的有效方法。在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，其已成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要指標(biāo)。但其只能證明抗酸桿菌的存在，不能區(qū)分結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌，在全球非結(jié)核分枝桿菌感染上升的背景下這使越來越多的涂陽病人有可能被誤診而接受不必要或不適當(dāng)?shù)目菇Y(jié)核治療。依靠培養(yǎng)的傳統(tǒng)菌種鑒定方法雖能達(dá)到區(qū)分兩者的目的，但在發(fā)展中國(guó)家的多數(shù)基層實(shí)驗(yàn)室尚無技術(shù)條件開展培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，上級(jí)分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室雖能開展，但其繁瑣又費(fèi)時(shí)，遠(yuǎn)不能滿足

3、臨床診療的需要。
　　目的：
　　了解NTM的流行狀況和流行病學(xué)特征，初步評(píng)價(jià)IS6110熒光定量PCR法快速鑒定陽性痰涂片中的結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)對(duì)抗酸染色陽性痰涂片刮取物擴(kuò)增分枝桿菌利福平耐藥基因（rpoB基因）進(jìn)行初步探索。
　　第一部分廣州市越秀、海珠區(qū)非結(jié)核分枝桿菌流行狀況分析
　　一、研究對(duì)象及方法：
　　選取2010年-2012年于越秀、海珠區(qū)兩個(gè)結(jié)核病防治所就診的可疑肺結(jié)核患者，

4、收集其痰分枝桿菌培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)室資料。對(duì)于在研究期間有多次陽性培養(yǎng)和菌菌種鑒定的同一病例只按1例計(jì)算，且選擇在時(shí)間上靠近研究起點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果納入統(tǒng)計(jì)分析。
　　每個(gè)病例均在清晨留取深部痰標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌液體培養(yǎng)檢測(cè)，培養(yǎng)分離的菌株通過PNB生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)進(jìn)行MTC與NTM初步鑒別，NTM分離株按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)操作規(guī)程通過分枝桿菌的培養(yǎng)特征及一系列生化測(cè)試鑒定其菌種。
　　二、結(jié)果：
　　1、可疑肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTC與NT

5、M的分離率分別為80.9％、19.1%。2010-2012各年度的NTM分離率分別為17.6%、17.1%、21.2%。
　　2、NTM分離者的男女比例為1.56：1，60歲及以上老年病例僅占26%，45-59歲、15-29歲年齡段為NTM分離高峰。
　　3、NTM菌種中快生長(zhǎng)型占50.6%，慢生長(zhǎng)型占49.4%。龜膿腫和鳥胞內(nèi)復(fù)合群為主要的分離菌種，分別占40.5%和24.1%。
　　第二部分痰涂片抗酸染色陽性患者分

6、枝桿菌的分離情況分析
　　一、研究對(duì)象及方法：
　　選取2012年~2013年于越秀、海珠區(qū)兩個(gè)結(jié)核病防治所診治的痰A(chǔ)FB涂片陽性且同期培養(yǎng)陽性的病例共331例。其中男性238例，女性93例(M/F=2.56)；年齡范圍15~87歲之間，平均39歲；初治225例，復(fù)治106例。
　　所有病例均于清晨留取深部痰標(biāo)本用于涂片抗酸染色及分枝桿菌分離培養(yǎng)和鑒定。
　　二、結(jié)果：
　　1、痰涂片AFB陽性患者中MTC

7、和NTM的分離率分別為81%和19%。2012年NTM分離率為14.1%，2013年為25.2%。
　　2、初治和復(fù)治涂陽患者NTM分離率分別為12%和34%。
　　3、MTC組涂片陽性等級(jí)≤1+占55.97%，>1+占44.03%。NTM組涂片陽性等級(jí)≤1+占82.54%，>1+占17.46%。
　　第三部分 IS6110-熒光定量PCR法快速鑒定抗酸染色陽性涂片中的結(jié)核分枝桿菌
　　一、研究對(duì)象及方法：

8、>　　331例同期培養(yǎng)陽性的抗酸染色陽性痰涂片來自2012年-2013年于越秀、海珠區(qū)結(jié)核病防治所就診的患者。其中陽性等級(jí)為1-9條/300視野的涂片25例，1+的涂片177例，2+涂片66例，3+涂片30例，4+涂片33例。根據(jù)其同期培養(yǎng)分群鑒定結(jié)果分為兩組，其中MTC組268例，NTM組63例。
　　應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑對(duì)所有痰涂片刮取物分枝桿菌 DNA行熒光定量PCR檢測(cè)。
　　二、結(jié)果：
　　1

9、、熒光定量PCR法初步鑒定陽性涂片中分枝桿菌菌群的靈敏度和特異度分別為69.40%、76.19%。
　　2、熒光定量PCR法在鑒定抗酸染色涂片陽性標(biāo)本中的分枝桿菌菌群與培養(yǎng)法一致程度較差（kappa=0.324）。
　　3、MTC組各陽性等級(jí)涂片的陽性檢出率分別為26.67%、63.70%、68.97%、92.86%、93.75%。
　　4、FQ-PCR檢測(cè)的靶基因拷貝數(shù)和涂片陽性等級(jí)存在正相關(guān)（r=0.563）。

10、r>　　第四部分抗酸染色陽性痰涂片刮削物擴(kuò)增分枝桿菌rpoB基因的初步探索
　　一、研究對(duì)象及方法：
　　18株臨床分離結(jié)核分枝桿菌來自廣州市胸科醫(yī)院“廣州地區(qū)分枝桿菌菌株庫(kù)”，80張抗酸染色陽性(3+～4+)痰涂片來自廣州市越秀區(qū)結(jié)核病防治所，涂片樣本來自經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)鑒定證實(shí)的肺結(jié)核患者。
　　設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以菌株、痰涂片刮取物中提取的基因組DNA為模板擴(kuò)增rpoB基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)。
　　二、結(jié)

11、果：
　　1、兩對(duì)引物對(duì)18例臨床分離株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，均能見到明亮目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證實(shí)為rpoB基因。
　　2、痰涂片刮削物DNA經(jīng)不同模板量、不同退火溫度，兩組引物分別行普通PCR、Touchdown PCR、巢式PCR、二次PCR擴(kuò)增rpoB基因均未有目的條帶。熒光定量PCR檢測(cè)兩種不同方法提取的痰涂片DNA拷貝數(shù)分別為102-103copies/ul和104-105copies/ul。
　　3、菌

12、株基因組DNA經(jīng)100-107一系列倍數(shù)稀釋后，兩對(duì)引物擴(kuò)增rpoB基因分別在104、103以下的稀釋倍數(shù)能觀察到明亮目的條帶，對(duì)應(yīng)的熒光定量PCR檢測(cè)拷貝數(shù)分別為106 copies/ul、107copies/ul。
　　結(jié)論：
　　1、可疑肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中NTM分離率19.1%。
　　2、NTM感染人群以中青年為主。
　　3、NTM以快速生長(zhǎng)分枝桿菌較多見。
　　4、涂陽患者NTM分離率為19%,20

13、13年涂陽患者NTM分離率明顯高于2012年。
　　5、復(fù)治涂陽病人比初治者更易分離到NTM。
　　6、非結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽性標(biāo)本以1+以下多見。
　　7、IS6110-熒光定量PCR法檢測(cè)到的結(jié)核分枝桿菌基因拷貝數(shù)與涂片陽性等級(jí)成正相關(guān)。
　　8、IS6110-熒光定量 PCR法可作為陽性等級(jí)3+以上痰涂片中分枝桿菌快速初步鑒定的較好方法。
　　9、陽性痰涂片刮取物中提取的DNA量不足是rpoB基因未能