NOS-NO系統(tǒng)活性在兔AMI心肌再灌注損傷中的作用及卡維地洛的干預.pdf

1、背景：急性心肌梗死(AMI)為冠狀動脈急性閉塞所致，其治療的關鍵是盡早行血運重建，使梗死相關冠脈(IRCA)再通，減輕缺血再灌注損傷(IRI)，實現心肌水平的理想再灌注。 近年研究證實，第三代β受體阻滯劑卡維地洛通過阻滯鈣通道、抑制中性粒細胞浸潤、保護心肌細胞線粒體、抗血管內皮細胞損傷、抗氧化、減少NO失活以及避免NO過量產生等機制在心肌缺血再灌注(IR)時起到重要的心肌保護作用。 目的：本研究采用阻斷及松解冠狀動脈左回

2、旋支之左室支(LAVB)的方法建立兔AMI再灌注模型。通過觀察兔AMI再灌注后不同時間段一氧化氮合酶(NOS)活性、NO、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)含量及NOSmRNA表達水平的變化，探討兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性的變化規(guī)律及卡維地洛的干預作用。本實驗共分4部分。 方法與結果： 1. 兔AMI再灌注模型的建立：方法日本大白兔24只為實驗對象，體重2.5～3.5kg，

3、雌雄不拘。隨機分為缺血再灌注組、缺血未灌注組及假手術組，每組8只。沿胸部正中皮膚切口，暴露縱隔及心臟，充分顯露LAVB，首先進行缺血預適應阻斷左室支血流5min后松開10min，再次阻斷5min松開10min，再次阻斷60min，然后缺血再灌注組松解進行再灌注，缺血未灌注組在穿線處結扎，假手術組只穿線不阻斷血流。整個造模過程行心電監(jiān)護及對癥處理，以保證實驗動物存活。3天后處死實驗動物，取梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)、正常心肌組織備用。采兔術前(基

4、線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時靜脈血，檢測cTnI,CK和CK-MB：行心電圖觀察П，Ш，avF導聯(lián)ST段抬高振幅總和變化；行心肌組織病理學檢查、伊文思蘭及TTC染色評價心肌壞死情況。所有數據以STATA8.0軟件包進行處理：計量資料以均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本均數間多重比較應用Scheffe檢驗；計數資料應用X2檢驗；相關變量間采用直線相關分析，以P

5、<0.05為統(tǒng)計學有顯著性差異。結果各組動物冠脈閉塞前、后體表心電圖及冠脈阻斷后П,Ш,avF導聯(lián)ST段均抬高，缺血再灌注組松解后120分鐘內ST段回落大于50％，而其它兩組無此表現。與術前相比，缺血再灌注組兔術后三項指標均增高，且cTnI,CK和CK-MB酶峰分別提前至8h，12h和10h；缺血未灌注組三項指標均增高，但無酶峰的前移；假手術組三項輕度升高，亦無酶峰的前移。缺血再灌注組及缺血未灌注組兔均符合2004中華醫(yī)學會心血管病學分

6、會制定的《急性心肌梗死診斷和治療指南》AMI的診斷標準，心肌組織病理學及TTC染色亦支持AMI診斷；缺血再灌注組兔均符合1991年《中華心血管病雜志》編輯委員會推薦的判斷IRCA是否再通的標準，伊文思蘭注入結果亦支持IRCA的再通。 2. 兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性的變化：方法日本大白兔24只為實驗對象，體重2.5～3.5kg，雌雄不拘，購自河北醫(yī)科大學動物室。隨機分為缺血再灌注組(IR group)、缺血未灌注組(A

7、MI group)及假手術組(sham group)，每組8只。假手術組開胸穿線但不阻斷冠脈血流，其它兩組給予造模處理。成功建立動物模型后采兔術前(基線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時靜脈血，檢測血清總NOS、誘導型NOS(iNOS)、內皮型NOS(eNOS)活性及NO水平。行伊文思蘭及TTC染色測定壞死及缺血區(qū)心肌占左室重量比，并觀察NO與缺血壞死心肌重量比的相關性。統(tǒng)計學處理同第一部分。結果各組觀察指標基線水

8、平比較P>0.05；缺血再灌注組NO含量在4、8、24及48小時時間點均高于缺血未灌注組(P<0.05)；缺血再灌注組NOS活性除72小時時間點外均高于缺血未灌注組，在8、12、24、48、72小時時間點NOS活性相比P<0.01；缺血再灌注組iNOS活性再灌注后各時間點均高于缺血未灌注組，4、8、12、24、48小時時間點兩組相比P<0.01；缺血再灌注組NO含量各時間點均低于假手術組，除4小時時間點外兩組相比P<0.01；缺血再灌注

9、組NOS活性4小時時間點高于假手術組，而其它時間點低于假手術組(P<0.01)；缺血再灌注組iNOS活性各時間點均高于假手術組，除72小時時間點外兩組相比P<0.01；缺血再灌注組再灌注后NO水平于4、8、12小時逐漸降低，于24小時增高后再次呈下降趨勢；NOS活性首先呈下降趨勢24小時增高而后各時間點繼續(xù)呈下降趨勢；缺血再灌注組再灌注后iNOS活性4小時開始升高24小時后呈下降趨勢；缺血未灌注組iNOS活性4小時開始升高而后至72小時

10、時間點一直呈升高趨勢。相關分析結果缺血再灌注組NO含量與壞死區(qū)心肌重量比例呈負相關(r=-0.8951。t=4.9175，p=0.0027)；NO含量與缺血區(qū)心肌重量比例亦呈負相關(r=-0.8368，t=3.7437，p=0.0096)。 3. 卡維地洛對兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性的影響：方法日本大白兔24只為實驗對象，體重2.5～3.5kg，雌雄不拘，隨機分為對照組(control group)、干預組(treat

11、ment group)及假手術組(sham group)，每組8只。對照組僅給予造模處理，干預組予卡維地洛灌胃7天后造模，假手術組開胸穿線但不阻斷冠脈血流。成功建立動物模型后采兔術前(基線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時靜脈血，檢測血清NO含量、總NOS、iNOS、eNOS活性及其mRNA表達水平；檢測cTnI,CK和CK-MB水平；行心電圖觀察П,Ш,avF導聯(lián)ST段抬高振幅總和變化；行血液動力學監(jiān)測觀察左室舒

12、張末壓(LVEDP)、左室收縮末壓(LVESP)及平均動脈壓(MABP)變化；觀察心肌組織學、心肌壞死及缺血區(qū)占左室重量比。統(tǒng)計學處理同第一部分。結果各組觀察指標基線水平比較P>0.05；干預組NO含量及NOS活性4、8、72小時時間點高于對照組，而12、24小時時間點低于對照組，除8小時時間點外兩組NO含量相比P<0.05，在4、8、12、24、48、72小時時間點NOS活性干預組與對照組相比P<0.01；干預組iNOS活性再灌注后各

13、時間點均低于對照組，在8、12、24、48小時時間點相比P<0.01；干預組NO含量及NOS活性4、8小時時間點高于假手術組，而其它時間點低于假手術組(P<0.01)；干預組iNOS活性除24小時稍低外余時間點均高于假手術組，在4、12、48、72小時時間點兩組比較P<0.01；iNOS活性于再灌注后4小時即開始升高24小時達峰值，NO及NOS除24小時時間點升高外其它時間點均呈下降趨勢。干預組與對照組72小時時間點心肌梗死邊緣組織eN

14、OS,iNOStuRNA表達相比有顯著統(tǒng)計學差異(p=0.0000)。各組動物冠脈閉塞前、后體表心電圖及冠脈阻斷后П，Ш,avF導聯(lián)ST段均抬高，對照組及干預組松解后120分鐘內ST段回落大于50％，而假手術組無此表現。與假手術組比較，對照組及干預組兔術后cTnI,CK及CK-MB等反映心肌損傷的指標均明顯升高，且酶峰分別提前至8，12及10小時。與假手術組比較，阻斷冠脈后對照組及干預組LVSP及MABP明顯降低，伴LVEDP明顯升高，

15、提示心肌收縮及舒張功能明顯受損。與對照組相比，干預組LVSP及MABP均較高，伴LVEDP減低，提示卡維地洛有改善心肌收縮及舒張功能作用。病理檢查干預組細胞腫脹及炎細胞浸潤均較對照組輕。伊文思藍及TTC染色結果顯示對照組及干預組的缺血區(qū)心肌占左心室比例分別為14.09％及10.31％，對照組及干預組的壞死區(qū)心肌占左心室比例分別為11.10％及8.01％，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(p=0.0000)。 4. 兔AMI再灌注后N

16、OS-NO系統(tǒng)活性與血清IL-8、TNF-α、及MDA水平變化關系的研究：方法日本大耳兔24只，隨機分為干預組、對照組及假手術組，每組8只。冠狀動脈夾閉60min后松解制備AMI后再灌注模型，對照組僅給予造模處理，干預組予卡維地洛灌胃7天后造模，假手術組開胸穿線但不阻斷冠脈血流。成功建立動物模型后采兔術前(基線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時靜脈血，檢測血清NOS、iNOS、eNOS活性及NO，IL-8，TNF-

17、α，MDA水平。并觀察血清IL-8，TNF-α與iNOS活性的相關性，同時觀察MDA與NO的相關性。統(tǒng)計學處理同第一部分。 結論： 1. 應用本研究制模方法可成功建立兔AMI再灌注模型，成功率高； 2. 兔AMI再灌注早期由于NOS活性減低使兔血清NO水平降低，再灌注后期由于iNOS的活化使兔血清NO水平升高，兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性變化與IRI有關，在一定時間范圍內，NO水平與心肌缺血壞死重量比呈負

18、相關； 3. 卡維地洛可以減少兔AMI再灌注后NO的失活及iNOS的活化，使NOS.NO系統(tǒng)活性維持在有利于心肌理想再灌注水平，從而減少兔AMI再灌注后心肌IRI，改善兔AMI再灌注后心肌收縮及舒張功能，減少兔AMI再灌注后心肌缺血壞死面積； 4. 干預組及對照組血清IL-8，TNF-α含量與iNOS活性呈正相關，MDA濃度與NO水平呈負相關；卡維地洛可以通過抑制炎癥介質的釋放及清除氧自由基(OFR)調控NOS-NO系統(tǒng)