雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)多表位亞單位疫苗的構(gòu)建與免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià).pdf

1、雞球蟲(chóng)病是由雞艾美爾球蟲(chóng)寄生于雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)引起的原蟲(chóng)病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失據(jù)，估計(jì)全世界每年直接和間接經(jīng)濟(jì)損失約有10-30多億美元，中國(guó)約30多億人民幣。藥物預(yù)防是目前防控雞球蟲(chóng)病的主要措施，隨著蟲(chóng)株耐藥和立法限制抗球蟲(chóng)藥物，人們更加重視免疫預(yù)防。雖然商品化活疫苗具有較好免疫保護(hù)效果，但是由于活疫苗存在使用不當(dāng)易爆發(fā)球蟲(chóng)感染等安全問(wèn)題以及較高的生產(chǎn)成本，以亞單位為基礎(chǔ)的新型分子疫苗成為研究者們近年研究的熱點(diǎn)。
　　具有

2、較好免疫原性的抗原是構(gòu)建以亞單位為基礎(chǔ)的新型分子疫苗的關(guān)鍵。通過(guò)研究雞球蟲(chóng)生活史后發(fā)現(xiàn)，位于子孢子和裂殖子前端的微線是構(gòu)成頂體復(fù)合器的重要組成部分，在蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中具有重要作用。目前，已證明多種微線蛋白具有良好的免疫原性。艾美耳球蟲(chóng)的頂膜抗原及其微線蛋白家族蛋白是球蟲(chóng)重要的微線蛋白，在球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞、移行以及胞內(nèi)生存方面發(fā)揮重要的作用。但球蟲(chóng)生活史復(fù)雜，一種抗原蛋白只在生命周期的部分階段出現(xiàn)，可能是導(dǎo)致以單一抗原為基礎(chǔ)的亞單

3、位疫苗等新型疫苗在抗球蟲(chóng)方面僅具有部分免疫保護(hù)力的原因之一。因此，改善抗原的免疫原性可能是一個(gè)快速和有效的方法。
　　球蟲(chóng)是胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，球蟲(chóng)入侵時(shí)機(jī)體可以誘發(fā)細(xì)胞免疫等的特異性免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫主要包括CD8+T淋巴細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）和CD4+T淋巴細(xì)胞（輔助性T細(xì)胞）兩種T淋巴細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在不同種類的球蟲(chóng)感染過(guò)程中發(fā)揮不同的作用而球蟲(chóng)抗原中的T細(xì)胞表位是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的關(guān)鍵。
　　為了改善抗原的

4、免疫原性，根據(jù)球蟲(chóng)生活周期及其抗原的表達(dá)，選取球蟲(chóng)不同階段表達(dá)的不同抗原蛋白，對(duì)其進(jìn)行蛋白氨基酸序列分析，選取有效的抗原表位構(gòu)建亞單位疫苗是一種改善抗原免疫原性的可行方案。
　　佐劑是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑,能夠提高抗原的免疫原性及改變免疫應(yīng)答的類型，延長(zhǎng)免疫期增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。不同佐劑的應(yīng)用會(huì)對(duì)機(jī)體免疫產(chǎn)生不同的影響，選擇合適的佐劑能增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生非特異性或特異性免疫反應(yīng)，可以提高疫苗免疫的效果,因此佐劑也成為人們?cè)鰪?qiáng)抗原免

5、疫原性的焦點(diǎn)之一。
　　本研究選取了球蟲(chóng)子孢子與裂殖子等入侵階段的微線蛋白2（EtMIC2）、微線蛋白3（EtMIC3）和頂膜抗原1（EtAMA1）等幾種重要的微線蛋白基因，利用SYFPEITHI和DNAStar等生物學(xué)軟件對(duì)其各自的蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析后，分別選擇T細(xì)胞表位較為豐富的片段作為亞單位疫苗的候選抗原基因，對(duì)基因克隆并線性串聯(lián)，測(cè)序正確后克隆入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白EtMIC2-EtAMA1

6、-EtMIC3。經(jīng) SDS-PAGE、Western-blot及 IFA鑒定，結(jié)果顯示重組大腸桿菌成功表達(dá)重組蛋白EtMIC2-EtAMA1-EtMIC3。將重組蛋白EtMIC2-EtAMA1-EtMIC3分別與PBS、弗氏佐劑、松花粉多糖、蜂膠佐劑等乳化后制作亞單位疫苗。在雛雞7和14日齡時(shí)頸部皮下多點(diǎn)注射免疫兩次，二免后七天除不免疫不感染球蟲(chóng)組（Ⅰ組）外皆接種30,000個(gè)新鮮柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊。結(jié)果顯示各蛋白免疫組相對(duì)于感染球蟲(chóng)不

7、免疫組（Ⅱ組），體重增長(zhǎng)顯著，病變積分以及克糞便卵囊數(shù)均顯著性降低（P<0.05）。而乳化佐劑組（IV,V和VI組）與單獨(dú)重組蛋白組（III組）比較體重增長(zhǎng)升高，病變積分以及克糞便卵囊數(shù)有所降低，其ACI結(jié)果顯示重組蛋白質(zhì)能夠?qū)η蛳x(chóng)感染提供良好的免疫保護(hù)力，且蜂膠在提高重組蛋白對(duì)球蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)效果方面作用最理想。淋巴細(xì)胞增殖效果及其外周血淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+的比例變化結(jié)果顯示重組蛋白可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，佐劑可以增強(qiáng)重組蛋白