AGEs-RAGE軸調(diào)控wnt-β-catenin促進(jìn)人主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化.pdf

1、目的:探討RAGE是否具有促進(jìn)動脈平滑肌細(xì)胞鈣化的功能，明確RAGE與wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系，探討RAGE與人動脈平滑肌細(xì)胞向成骨性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛在關(guān)系。
　　方法:(1)通過慢病毒顆粒載體介導(dǎo)的RAGE ORF感染細(xì)胞，以建立穩(wěn)定高表達(dá)RAGE蛋白的細(xì)胞模型。綠熒光蛋白表達(dá)、流式細(xì)胞技術(shù)及免疫印跡法檢測驗證細(xì)胞穩(wěn)定高表達(dá)RAGE蛋白。(2)將正常條件下培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細(xì)胞作為空白對照組，分為空白對照組、未轉(zhuǎn)染

2、慢病毒組，空載體慢病毒轉(zhuǎn)染組、攜帶RAGE慢病毒轉(zhuǎn)染組，對未轉(zhuǎn)染慢病毒組，空載體慢病毒轉(zhuǎn)染組、攜帶RAGE慢病毒轉(zhuǎn)染組分別以10mmol/Lβ-甘油磷酸、丙酮酸和20mmg/L AGE共同作用下對各組人主動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長情況及鈣化情況，第10天時對各組細(xì)胞進(jìn)行馮庫薩染色和鈣定量檢測。(3)將正常條件下培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細(xì)胞作為空白對照組，分為空白對照組、空載體慢病毒轉(zhuǎn)染組、RAGE高表達(dá)細(xì)胞

3、組，分別以10mmol/Lβ-甘油磷酸、丙酮酸和20mmg/L AGE共同作用下對各組人主動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，利用western blotting檢測干預(yù)前和干預(yù)后各組細(xì)胞與成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。(4)利用小分子干擾RNA對細(xì)胞β-catenin的表達(dá)進(jìn)行干擾，從而獲得β-catenin低表達(dá)細(xì)胞模型。仍然以正常條件下培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細(xì)胞為空白對照組，將實驗分為空白對照組、RAGE高表達(dá)細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)組、對照siRNA組以及

4、β-catenin siRNA抑制組，對經(jīng)β-catenin si RNA處理過的細(xì)胞組進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)。利用蛋白印跡技術(shù)對各組細(xì)胞OPG、cabfa1的表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:(1)綠熒光蛋白表達(dá)、流式細(xì)胞技術(shù)及免疫印跡法檢測結(jié)果證實RAGE高表達(dá)人主動脈平滑肌細(xì)胞模型成功建立。(2)與空白對照組、未轉(zhuǎn)染慢病毒組，空載體慢病毒轉(zhuǎn)染組相比，在鈣化+AGEs干預(yù)培養(yǎng)下，攜帶RAGE慢病毒轉(zhuǎn)染組的鈣化程度增強。(3)空白對照組、空載體慢

5、病毒轉(zhuǎn)染組、RAGE高表達(dá)細(xì)胞組三組細(xì)胞在進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)后，RAGE、β-catenin、OPG、cabfa1蛋白表達(dá)較未干預(yù)均增強，其中RAGE高表達(dá)組細(xì)胞中上述因子的表達(dá)遠(yuǎn)強于其他各組。(4)與RAGE高表達(dá)細(xì)胞組和對照siRNA細(xì)胞組相比，β-catenin siRNA抑制組細(xì)胞經(jīng)β-cateninsiRNA處理后再進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其下游基因cabfa1和OPG的表達(dá)明顯受到了抑制。
　　結(jié)論:1.RAGE高表達(dá)促進(jìn)VSMC